Начните с нанесения покрытия на внеклеточный матрикс на вставки для клеточных культур для 2D-монослойной культуры, полученной из органоидов. Нанесите 100 микролитров покрытия внеклеточного матрикса на апикальную камеру каждой подготовленной вставки для клеточной культуры и закройте крышкой. Затем инкубируйте планшет для клеточной культуры во влажном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение одного часа.
Для ректальных органоидных клеток после инкубации покрытие внеклеточного матрикса заменить ректальной монослойной питательной средой и инкубировать в течение ночи. После ферментативного расщепления органоидов и фильтрации до отдельных клеток центрифугируйте клеточную суспензию при 200 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия, а затем выбросьте надосадочную жидкость. Затем приготовьте 200 микролитров клеточных суспензий на одну вставку для клеточной культуры в монослойных питательных средах.
Извлеките 24-луночный планшет для клеточной культуры, содержащий вставки для клеточных культур, покрытых внеклеточным матриксом. Используя вакуумное отсасывание, осторожно опорожните апикальную камеру каждой вставки для клеточной культуры, чтобы не нарушить покрытие. Осторожно нанесите 200 микролитров суспензии одиночных клеток на апикальную камеру каждой вставки для клеточной культуры.
Добавьте по 500 микролитров соответствующим образом дополненной монослойной питательной среды в базолатеральную камеру каждой лунки. Затем инкубируйте планшет во влажном инкубаторе, чтобы способствовать адгезии и росту клеток, образуя сливающийся 2D-монослой на вставке для клеточной культуры. Меняйте питательные среды как в апикальной, так и в базолатеральной камерах через день, начиная с 48 часов после посева клеток.
Для иммунофлуоресцентного окрашивания 2D-монослоя, полученного из органоидов, аккуратно вырежьте мембрану вставки клеточной культуры лезвием скальпеля и поместите вставку для клеточной культуры на предметное стекло. Добавьте монтажный носитель на защитное стекло и поместите его на предметное стекло перед осмотром ячеек. На следующий день после посева диссоциированных зрелых органоидов на вставку для клеточной культуры, по-видимому, образовался 2D-монослой.
С помощью сканирующей электронной микроскопии через пять суток после посева были выявлены хорошо развитые микроворсинки и клеточная демаркация на апикальной поверхности 2D-монослоев. Иммунофлуоресцентное окрашивание 2D-монослоев подтвердило наличие апикальной щеточной границы, базолатеральных адгезивных соединений и слизепродуцирующих бокаловидных клеток как в подвздошных, так и в ректальных органоидных 2D-монослоях.
