Для начала получите обогащенную тромбоцитами плазму путем центрифугирования цитратной антикоагулянтной цельной крови в дозе 200 г в течение 20 минут. Добавьте в плазму индометацин и PGE1 и центрифугируйте при 500г в течение 10 минут. Ресуспендируйте полученную тромбоцитарную гранулу в модифицированном буфере Tyrode's HEPES при температуре 37 градусов Цельсия до получения плотности 2x10^8 тромбоцитов на миллилитр.
Дайте тромбоцитам отдохнуть в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Добавьте DETC до конечной концентрации 5 микромоляров и дефероксамин до конечной концентрации 25 микромоляров в суспензию тромбоцитов, а затем CMH до конечной концентрации 200 микромоляров. Поместите образцы в агрегационные кюветы, оснащенные магнитами с тефлоновым покрытием, и загрузите их на агрегатометр.
Через минуту добавьте раздражители, такие как тромбин или коллаген, и инкубируйте в течение 10 минут. После инкубации перенесите суспензию тромбоцитов из агрегационной кюветы в микроцентрифужную пробирку и быстро уменьшите при 6 000 г в течение 10 секунд. Загрузите 50 микролитров надосадочной жидкости в капиллярные микропипетки и запечатайте сургучом EPR.
Перенесите образцы на сканер ЭПР и установите параметры на сканере. Оцените окисление CMH до радикала CM как площадь под кривой зарегистрированных пиков ЭПР. Получение калибровочной кривой с использованием коммерчески доступного радикала CM.
Интенсивность сигнала ЭПР в образцах была пропорциональна интенсивности пиков ЭПР. Специфичность детектирования подтверждена с помощью поглотителей АФК и селективных ингибиторов ферментов, образующих супероксид-анион. Данные по стимуляции тромбоцитов тромбином или коллагеном в присутствии селективного ингибитора VAS2870 свидетельствуют о том, что NADPH-оксидазы являются основным источником тромбоцитарных супероксид-анионов в ответ на оба этих агониста.
