Получение индуцированных микроглиоподобных клеток из моноцитов, полученных из цельной крови, для исследования динамики микроглии при заболеваниях человека

Для начала получите мононуклеарные клетки человека из цельной крови. Вихревой аппарат человека, блокирующий FcR, и добавьте необходимое количество реагента в клетки. Инкубируйте трубку с клетками при температуре четыре градуса Цельсия в течение пяти минут.

Добавьте 20 микролитров CD11b MicroBeads на 10 в размере семи общих клеток, и инкубируйте при четырех градусах Цельсия в течение 20 минут. Тщательно продезинфицируйте магнитную подставку 70%-ным этанолом. После инкубации добавьте 10 миллилитров изоляционного буфера.

Перемешайте и центрифугируйте пробирку при температуре 300G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Как только подставка высохнет, установите магнитную колонку на магнитную подставку. После удаления надосадочной жидкости добавьте один миллилитр изоляционного буфера и аккуратно перемешайте с помощью пипетки.

Затем загрузите суспензию элемента в колонку и трижды промывайте ее тремя миллилитрами изоляционного буфера каждый раз, когда резервуар колонки опустошается. Поместите колонку в коническую трубку объемом 15 миллилитров, не касаясь магнитной части. Добавив пять миллилитров изоляционного буфера, вставьте поршень в трубку, чтобы вытеснить жидкость через колонку.

Центрифугируйте клеточную суспензию, собранную в пробирку. Аспирируйте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в изолированной среде. После подсчета клеток внесите 500 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку 24-луночного планшета и инкубируйте в течение ночи.

Чтобы индуцировать микроглию-подобные клетки, замените изоляционную среду от посева предыдущего дня на индукционную среду и инкубируйте клетки в течение 14 дней. Индуцированные клетки, подобные микроглии, демонстрировали мельчайшие тела сомы и многочисленные разветвленные коллатерали.