Для начала разложите необходимые экспериментальные материалы на рабочей площадке. Добавьте 100 микролитров стерильного 0,4%-ного раствора желатина в лунки 96-луночного дна с черными стенками. Инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 30 минут.
Под инвертированным микроскопом подтвердите, что эндотелиальные клетки в колбе T75 на 80–100% сливаются. Извлеките готовую среду DMEM из колбы с помощью аспирации. Чтобы промыть клетки, добавьте 10 миллилитров PBS и аккуратно встряхните колбу.
Замените PBS пятью миллилитрами раствора для диссоциации клеток. Инкубируйте колбу при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение примерно 12 минут. Постучите по колбе через шесть минут.
Чтобы облегчить диссоциацию. Добавьте в колбу пять миллилитров предварительно подогретой среды DMEM Complete и перемешайте клеточную суспензию. С помощью серологической пипетки объемом 10 миллилитров переложите клеточную суспензию в стерильную 50-миллилитровую пробирку и центрифугируйте при 150 G в течение пяти минут.
Тем временем, с помощью пипетки-пасторки, подключенной к вакууму, аспирируйте раствор желатина из 96-луночной пластины. После центрифугирования клеток извлеките супернатин из пробирки, не потревожив гранулу. С помощью серологической пипетки добавьте в пробирку восемь миллилитров свежей полной среды DMEM и аккуратно пипетируйте суспензию, чтобы разбить клеточную гранулу.
Подсчитайте клетки с помощью синего триппена на гемоцитометре. Добавьте полноценную среду DMEM, чтобы получить плотность 600 000 клеток на миллилитр суспензии. Перемешайте клеточную суспензию, аккуратно перевернув трубку.
Добавьте клеточную суспензию в многоканальный резервуар для пипетки объемом 50 миллилитров. Каждые 30 секунд осторожно покачивайте резервуар из стороны в сторону, чтобы перемешать суспензию, и с помощью многоканальной пипетки добавляйте по 100 микролитров в каждую лунку из 96-луночной пластины, покрытой желатином. Установите на место прозрачную крышку тарелки и осторожно встряхните пластину, сдвинув ее по поверхности стерильной капюшона с севера на юг и с востока на запад.
Инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение 16-24 часов.
