После выращивания эндотелиальных клеток в 96-луночной пластине извлеките ее из инкубатора и подтвердите слияние с помощью инвертированного микроскопа. Поместите тарелку в раковину, чтобы удалить весь носитель, и промокните верхнюю часть тарелки бумажным полотенцем. Добавьте буфер для анализа HBSS HEPES и раствор пробенецида в 50-миллилитровый резервуар для многоканального растворителя для пипетки.
С помощью многоканальной пипетки добавьте по 100 микролитров буфера для анализа в каждую лунку и дайте клеткам постоять в течение пяти минут. Затем прокрутите пластину, чтобы удалить буфер для анализа. Добавьте загрузочный буфер в отдельный 50-миллилитровый резервуар для многоканального растворителя для пипетки.
С помощью многоканальной пипетки добавьте по 50 микролитров буфера для загрузки красителя в каждую лунку пробирной пластины. Инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 45 минут. После инкубации понаблюдайте за планшетом под флуоресцентным микроскопом, чтобы подтвердить поглощение красителя.
Поверните пластину, чтобы удалить раствор красителя. Дважды промойте клетки 50 микролитрами буфера для анализа HBSS HEPES плюс раствор пробенецида в каждой лунке. Поверните пластину, чтобы удалить буфер для анализа.
Добавьте 92 микролитра буфера для анализа HBSS HEPES в каждую лунку и снова осмотрите клетки с помощью флуоресцентного микроскопа, чтобы убедиться, что избыток красителя был полностью удален и что клетки остаются адгезивными. С помощью многоканальной пипетки добавьте два микролитра раствора антагониста и носитель в соответствующие лунки. После включения считывателя пластин установите температуру на 37 градусов Цельсия и выдержите пластину в течение 15 минут.
Измерьте фоновую флуоресценцию в первом и втором столбцах, выполнив пять сканирований в каждой лунке. Извлеките планшет из считывателя планшетов, затем из 8-пробирочной ПЦР-полоски быстро добавьте шесть микролитров раствора агониста с помощью многоканальной пипетки в каждую лунку в первой и второй колонках. Измерьте изменение флуоресценции по мере того, как в клетках происходит мобилизация кальция.
Выполните по 20 сканирований каждой лунки. Анализ на мобилизацию кальция с эндотелиальными клетками показал, что положительные контрольные лунки без антагониста демонстрируют быстрое увеличение флуоресценции. Лунки с высокими концентрациями антагонистов показали минимальное изменение флуоресценции, аналогично лункам с отрицательным контролем без агониста.
