Для начала необходимо получить активно растущие человеческие желудочные органоиды диаметром от 200 до 700 микрометров. Размораживайте внеклеточный матрикс, или ВКМ, на льду в течение не менее 45 минут. И предварительно нагрейте планшеты для клеточных культур при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе с 5% углекислым газом.
После удаления среды из лунок культурального планшета пипеткой нанесите ледяной PBS на каждую каплю ECM. И поцарапайте гель наконечником для пипетки P-1000. Соберите PBS с фрагментами ECM, содержащими органоиды, в коническую пробирку объемом 15 миллилитров.
Центрифугируйте пробирку при температуре 200G при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. После аспирации надосадочной жидкости добавьте 350 микролитров 0,25% Trypsin-EDTA в каждую пробирку и аккуратно перемешайте. Инкубируйте трубки на водяной бане, температурной до 37 градусов Цельсия, в течение двух-пяти минут.
Добавьте в каждую пробирку по 600 микролитров ледяного DMEM, дополненного пенициллином и стрептомицином, и энергично пипетируйте вверх и вниз 40 раз. Центрифугируйте пробирку, как показано на рисунке, и повторно суспендируйте палитру клеток в ледяном жидком ECM. Для каждого образца наберите 40 микролитров жидкого ЭХМ, содержащего фрагменты органоидов, в тонкую горизонтальную линию по диаметру 35-миллиметрового стеклянного дна.
После 15-30 минут инкубации осторожно добавьте два миллилитра органоидной расширительной среды в тарелку по краю чашки, не нарушая полимеризованный гель.
