Этот протокол позволяет визуализировать трехмерные структуры в полной почке, что может привести к инновационным открытиям в исследованиях почек, обеспечивая макроскопическую перспективу. Окрашивание органов цельным креплением является сложной задачей из-за сложности проникновения антител. Этот протокол продемонстрировал высокое качество, полностью установленное окрашивание почек антителами.
Для начала выполните фиксацию погружения сразу после фиксации перфузии и забора проб почек, погружая почку в 4%-ный параформальдегид при четырех градусах Цельсия в течение 16 часов. Дайте три стирки с использованием PBS в течение двух часов каждая. Выполните процесс обесцвечивания и делипидации, погружая неподвижную почку в семь миллиметров 50% CUBIC-L в 14-миллилитровую трубку с круглым дном, с легким встряхиванием при комнатной температуре.
Через шесть часов погрузить почку в семь миллилитров CUBIC-L в 14-миллиметровую трубку с круглым дном, с легким встряхиванием при 37 градусах Цельсия в течение пяти дней. Обновляйте CUBIC-L каждый день. После завершения обесцвечивания и делипидации используйте дозирующую ложку для обработки образцов и трижды промывайте почки PBS при комнатной температуре в течение двух часов.
Разбавить делипидированную почку в первичных антителах, разведенных в окрашивающем буферном растворе, с легким встряхиванием в шейкере инкубатора при 37 градусах Цельсия в течение семи дней. Затем промывайте почки 0,5% тритоном X-100 в PBS, также известным как PBST, при комнатной температуре в течение одного дня. Для окрашивания вторичных антител обрабатывают почки вторичными антителами в буфере окрашивания, в темноте, с легким встряхиванием при 37 градусах Цельсия в течение семи дней.
Зафиксируйте окрашивание с помощью промывки PBST при комнатной температуре в течение одного дня. После фиксации погружают почку в 1%-формальдегид в ПБ на три часа, и промывают ее ПБС при комнатной температуре в течение шести часов. Выполняют согласование показателя рефракции путем погружения почки в семь миллилитров 50%CUBIC-R+ в 14-миллилитровую трубку круглого дна с встряхиванием на один день, с последующим лечением семью миллилитрами CUBIC-R+ с встряхиванием при комнатной температуре в течение двух дней.
С помощью метода иммунного окрашивания симпатические нервы и артерии во всей почке были визуализированы в 3D-визуализации почек. Более того, аномальные почечные симпатические нервы были визуализированы после ишемии-реперфузионной травмы. Этот протокол также облегчал визуализацию симпатических нервов во всей селезенке.
Процесс количественной оценки данных для трехмерного иммунофлуоресцентного окрашивания показан здесь. Кроме того, собирали протоки, сегмент S1 проксимальных канальцев и клубочки успешно визуализировались в целой почке. Подавленная гломеруломегалия, возникающая в результате введения препарата на ранних стадиях диабетической болезни почек, также визуализировалась в 3D-визуализации.
Этот протокол может маркировать конкретную молекулу во всей почке. Таким образом, исследователи могут проанализировать изменение структуры в сосудистой системе или найти редкие события в тканях почек.
