Для начала поместите формальный и неподвижный мышиный глаз на лист вощеной бумаги под препарирующим микроскопом. С помощью пары микрощипцов удерживайте остатки мышцы и зрительного нерва. Затем ориентируйте глаз так, чтобы роговица была обращена в одну сторону.
Теперь с помощью хирургического лезвия сделайте разрез длиной от одного до двух миллиметров позади и параллельно лимбу. Прикладывайте нисходящее усилие лезвием, удерживая глаз на месте, пока передний сегмент не отделится от заднего конца. Затем выбросьте передний сегмент и хрусталик.
Переложите задний сегмент в шестисантиметровую миску, наполненную PBS. С помощью микрошпателя вычерпните сетчатку, одновременно удерживая зрительный нерв микрощипцами. Чтобы промыть сетчатку глаза, перенесите ее в лунку из 12-луночной пластины, которая имеет шесть лунок, заполненных двойной дистиллированной водой.
С помощью пипетки P1000 осторожно нагнетайте воду вверх и вниз по сетчатке, одновременно обдувая водой, чтобы вызвать легкое возбуждение. Далее с помощью пипетки из перевернутого стекла перенесите сетчатку во вторую лунку. Чтобы переварить сетчатку, переведите промытую сетчатку в раствор трипсина в 12-луночный планшет с пипеткой из перевернутого стекла.
Центрируйте пропитанный трипсином наконечник пипетки P200 на зрительном нерве. Затем аккуратно пипетируйте всю сосудистую сеть вверх и вниз, чтобы диссоциировать несосудистую ткань. Теперь используйте пипетку из перевернутого стекла, предварительно промытую в трипсине, чтобы перенести сосудистую сеть сетчатки в лунку, содержащую двойную дистиллированную воду в шестилуночной пластине.
Вращайте пластину, затем пипетируйте сосудистую сеть вверх и вниз с помощью перевернутой стеклянной пипетки, промываемой трипсином, чтобы удалить остатки несосудистой ткани. Осторожно перенесите сосудистую сеть сетчатки в центр отмеченной области на предметное стекло для микроскопии заряженной поверхности. Затем с помощью пипетки P200 осторожно удалите лишнюю воду с одного края.
Поместите предметное стекло в шкаф биобезопасности ближе к передней стороне, чтобы остатки воды испарились. Когда сосудистая сеть почти высохнет, перенесите ее под фазово-контрастный микроскоп. С помощью пипетки P200 медленно добавьте двойную дистиллированную воду с одной стороны отмеченной области, чтобы осторожно увлажнить сосудистую систему.
Фиксация изолированной сосудистой сети сетчатки привела к получению структурно прочной и достаточно долговечной ткани, пригодной для измерений методом АСМ. Напротив, сосуды сетчатки, изолированные от незафиксированных или кратковременно зафиксированных глаз, фрагментировались и разрушались.
