Приготовление суспензии одноклеточного эмбриона для анализа методом проточной цитометрии для оценки ксенотрансплантации опухоли

Для начала получите эмбрионы рыбок данио, которым введут клетки лейкемии, предварительно окрашенные CM-Dil. Перенесите обезболенные эмбрионы в центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра и с помощью пипетки P200 растворите желток в 100 микролитрах раствора Ringer без кальция в течение пяти минут. Инкубируйте каждый образец дежелтковых эмбрионов с одним миллилитром раствора трипсинколлагеназы при температуре 29 градусов Цельсия в течение 30-35 минут.

С помощью наконечника P1000 пипетируйте эмбрионы вверх и вниз в этом растворе каждые пять минут до тех пор, пока структура позвоночника не исчезнет. Чтобы остановить реакцию, добавьте в пробирку 200 микролитров FBS. Хорошо перемешайте и выдержите еще пять минут.

Гранулируйте клеточную суспензию при 300 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. После того, как надосадочная жидкость будет удалена, промойте клеточную гранулу два раза в охлажденном PBS и процедите клетки через сетчатое фильтр 70 микрометров. После промывки клеток ресуспендировать клеточную гранулу в красящей среде, содержащей антитело, реагирующее с трансплантированными клетками.

Инкубируйте клетки при температуре четыре градуса Цельсия в течение 20 минут. Гранулируйте клетки и ресуспендируйте их в 200 микролитрах красящей среды, содержащей одну микромолярную спираль и P Blue. Переложите клеточную смесь в пятимиллилитровую поликарбонатную трубку с круглым дном и проведите проточную цитометрию.

Двойная маркировка позволила измерить различия в опухолевой нагрузке между хорошей и низкой болюсной инокуляцией.