После восстановления CD8, полученных из кокультуры, центрифугируйте их при 1100 г в течение 10 минут в 10 миллилитрах полной питательной среды. Ресуспендируйте 1 х 10 в объеме 7 клеток в 100 микролитрах микрогранул для удаления мертвых клеток и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре. Поместите разделительные колонки в магнитный сепаратор и промойте их связующим буфером.
Перенесите суспензии ячеек в разделительные колонны и соберите проточные. После промывки столбика соберите неразмеченные ячейки, которые проходят через него, и объедините их с ранее собранными проточными. Центрифуга, обогащенный живым CD8, перекрестно загрунтованным при 1100 г в течение пяти минут в полной питательной среде.
После подсчета культивируют перекрестно-праймированные клетки CD8 со свежими клетками MCA205 в соотношении два к одному в 12-луночных планшетах и инкубируют при 37 градусах Цельсия и 5% углекислом газе в течение 72 часов. Перед восстановлением эффекта CD8 добавьте монензин и брефелдин в культуры иммунных клеток рака в течение шести часов. Затем восстановите эффектор CD8 и дважды центрифугируйте при 1100 г в течение пяти минут.
Ресуспензируют клетки в трех различных первичных смесях антител, приготовленных в холодном буфере FACS, и инкубируют в течение 20 минут при температуре 4 градуса Цельсия, защищая от света. Добавьте в небо клетки 100 микролитров раствора фиксации из смеси С и инкубируйте в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия в темноте. Ресуспендируйте клетки в холодном буфере для промывки и инкубируйте в течение 30 минут при температуре четыре градуса Цельсия.
После двойной промывки клеток в буфере FACS добавьте 100 микролитров PBS, содержащего корректируемый аквакраситель Vitality, в клеточные гранулы на 30 минут. Идентификация интересующих ячеек на основе их свойств FSCA и SSCA. Затем нанесите графики FSCA и FSCH, чтобы исключить дублеты и скопления ячеек из анализа.
Построение графика эмиссионного полосового фильтра 525/50 нм и SSCA для удаления мертвых клеток, используя полосовые фильтры 660/20 и 780/60 нм, определение положительного результата клеток для CDAA и CD3 на графиках плотности двух параметров. Далее анализируют клетки на CD44, CD25 и CD69 маркеры на CD137, а также на интерферон гамма-положительный и гранзим B на смесь А, В и С соответственно. Для анализа на уничтожение опухолей дополните среду для кокультуры красителем для количественного определения гибели клеток в реальном времени.
После нагрева пластины до 37 градусов Цельсия в системе анализа живых клеток выполняйте сканирование данных каждые два часа в течение 72 часов. Дважды центрифугируйте клетки при 1000 г в течение пяти минут. Окрашивают клетки на поверхностные маркеры 20 микролитрами холодного буфера FACS и инкубируют в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия в темноте.
Затем добавьте краситель для жизненных сил йодид пропидия для окрашивания клеток для стратегии стробирования. Определите интересующие ячейки на основе их свойств FSCA и SSCA. Затем нанесите графики FSCA и FSCH, чтобы исключить дублеты и скопления ячеек из анализа.
Используйте фильтр пропускания излучения 450/50 нанометров для обнаружения раковых клеток, отрицательных на CD45. На гистограмме с одним параметром, используя полосовой эмиссионный фильтр 610/620 нанометров, проанализируйте ячейки на предмет включения йодида пропидия в качестве средней интенсивности флуоресценции. С помощью многопараметрической проточной цитометрии повышали поверхностные уровни экспрессии маркера ранней активации CD69, маркеров поздней активации CD44 и CD25, мембранной экспрессии CD137 и CD107, маркеров реактивности опухоли.
Внутриклеточные уровни цитотоксических молекул, гранзима В и интерферона гамма-положительного постепенно и значительно повышались, достигая пика экспрессии через 72 часа совместной культуры. Родственные ко-культивируемые клетки MCA205 претерпевали значительные уровни CD8-эффекторной гибели.
