Для начала приготовьте шесть нематод для роста питательных сред или пластины NGM агара. На следующий день добавьте в тарелки 200 микролитров культуры Escherichia coli OP50, и выдерживайте при комнатной температуре в течение суток. После инкубации добавьте 200 микролитров 0,025 молярной D-глюкозы в четыре агаровые пластины NGM и дайте им высохнуть при комнатной температуре.
Перенесите различные стадийные три-четыре куска Caenorhabditis elegans Bristol N2 с агаровой пластины для технического обслуживания NGM на новую пластину NGM с посадкой на E.coli OP50. Инкубируйте червей C.elegans при температуре 20 градусов Цельсия при влажности более 95% в течение трех дней. Через три дня добавьте на тарелку дистиллированную воду и с помощью пастеровской пипетки соберите червей.
Переложите собранных червей в 50-миллилитровую центрифужную пробирку и дайте им отстояться под действием силы тяжести, прежде чем удалить надосадочную жидкость из пробирки. Затем добавьте в пробирку дистиллированную воду. Как только объем тюбика уменьшится до пяти миллилитров, добавьте 10 миллилитров отбеливающего раствора и энергично встряхивайте тюбик в течение примерно шести минут.
Затем заполните пробирку до емкости 50 миллилитров буфером M9, и центрифугируйте при 1400 г в течение трех минут. Удалите надосадочную жидкость до пяти миллилитров и добавьте в пробирку 45 миллилитров буфера М9. После последней промывки удалите надосадочную жидкость до отметки 15 миллилитров и переложите оставшуюся жидкость в тарелку.
Понаблюдайте за планшетом под микроскопом на предмет выхода яиц, и поместите планшет при температуре 20 градусов Цельсия с влажностью более 95% на 14 часов. После инкубации соберите червей в 15-миллилитровую трубку. С помощью автоматической пипетки добавьте 10 микролитров синхронизированных червей на предметное стекло микроскопа.
Подсчитайте количество червей и рассчитайте объем, необходимый для получения от 500 до 1000 червей на микролитр. Перенесите от 500 до 1000 личинок первой стадии, или L1, синхронизированных червей на агаровые пластины NGM. Предварительно подготовленный и засеянный кишечной палочкой OP50 и глюкозой.
Инкубируйте пластину при температуре 20 градусов Цельсия до тех пор, пока черви не достигнут четвертой стадии личинок, или L4. Через 48 часов добавьте на тарелку буфер M9, и с помощью пастеровской пипетки соберите личинки L4. Переложите собранных личинок в пробирку объемом 1,5 миллилитра. Разработайте график анализов для трех экспериментальных групп.
Перенесите примерно по 100 микролитров суспензии червей из каждой группы в микропробирку объемом 1,5 миллилитра, содержащую 400 микролитров 5%-ного раствора йода Люголя. Аккуратно взбалтывайте трубку в миксере в течение пяти минут. Сняв трубку со смесителя, подождите, пока черви самотеком осядут.
Промойте червей трижды одним миллилитром буфера M9. После повторного суспендирования червей в 100 микролитрах М9 буфера. Перелейте примерно 50 микролитров на предметное стекло.
Поместите защитный листок на предметное стекло. Далее на стереомикроскопе выберите режим светлого поля и понаблюдайте за червями. Сохраните изображения, содержащие не менее 10 червей на группу, в виде файла jpeg.
Наконец, рассчитайте содержание гликогена на основе йодного окрашивания червей. Визуальное наблюдение за анализом содержания гликогена показало, что у голодающих червей наблюдалось более слабое окрашивание по сравнению с теми, кого кормили E.coli OP50 и E.coli OP50 и D-глюкозой, которые демонстрировали наиболее интенсивное окрашивание.
