Для начала перенесите от 500 до 1000 червей стадии L1 синхронизированных Caenorhabditis elegans на агаровую пластину NGM и инкубируйте при температуре 20 градусов Цельсия до дня испытания. Разработка графика анализов для двух экспериментальных групп. Используя буфер M9, соберите червей L4 и взрослых червей в соответствующий день.
Переложите собранных червей в микропробирки объемом 1,5 миллилитра и подождите, пока черви осядут под действием силы тяжести. Промойте червей трижды одним миллилитром буфера М9, оставив примерно 500 микролитров в тюбике после последней промывки. С помощью автоматической пипетки добавьте 10 микролитров суспензии червя на предметное стекло микроскопа и рассчитайте объем, необходимый для получения 100 червей на микролитр.
В новую микропробирку добавьте объем, необходимый для 100 червей, и 100 микролитров 25% раствора соли эриоглауцина динатрия. Затем добавьте 200 микролитров культуры E.coli OP50 и увеличьте объем до 500 микролитров с помощью буфера M9. Инкубируйте трубку в течение трех часов с перемешиванием в миксере, защищая ее от света.
После инкубации дайте червям осадиться под действием силы тяжести, прежде чем промыть их одним миллилитром буфера M9 до полного удаления раствора для окрашивания. После последней промывки снова суспендируйте червей в 250 микролитрах буфера M9 и перенесите примерно 50 микролитров на предметное стекло. Установите крышку и выдержите предметное стекло при температуре 20 градусов Цельсия в течение 10 минут, чтобы парализовать червей.
С помощью стереомикроскопа в режиме яркого поля подсчитайте общее количество червей и общее количество окрашенных червей. Анализ кишечной проницаемости показал сильный кишечный барьер у молодых червей, предотвращающий утечку красителя. Напротив, у старых червей наблюдалась экстравазация красителя по всему телу, что указывает на повреждение кишечной мембраны.
