Для начала приготовьте раствор селенопротеина с использованием анализа теплового сдвига или буфера TSA. дозируйте белок, малые молекулы и оранжевый краситель SYPRO в соответствующие лунки 384-луночного планшета. Накройте пластину оптически прозрачной клейкой пленкой и кратковременно опустите пластину при плотности 1 000 г в течение одной минуты в центрифуге.
Затем поместите планшет в ПЦР-машину в режиме реального времени и запрограммируйте ее на удержание образца при температуре 20 градусов Цельсия в течение двух минут, после чего температура будет повышаться на 0,5 градуса в минуту до 95 градусов Цельсия. Экспорт данных с аппарата RT PCR для единиц относительной флуоресценции или RFU по отношению к температуре. Используя выбранное программное обеспечение, извлекайте и стройте графики точек данных с точностью до самой высокой интенсивности, измеренной для каждой кривой плавления.
Определите температуру плавления с помощью сигмоидальной подгонки Больцмана, чтобы получить данные для определения температуры плавления или Tm.Кривые термической денатурации показали увеличение термостабильности Escherichia coli SelO на четыре градуса Цельсия в присутствии АТФ с ионами магния и повышение на 12 градусов Цельсия для АТФ с ионами марганца. Тем не менее, не наблюдалось сдвига в термической стабильности при инкубации с UTP, что указывает на то, что Escherichia coli SelO может не проявлять обнаруживаемого связывания с UTP. Контроль без белка и без красителя имел низкий флуоресцентный сигнал, который не реагировал на повышение температуры.
