Для начала приготовьте смеси сыворотки и ферментов вместе с соответствующими контрольными группами. В считывателе микропланшетов настройте протокол кинетического считывания для измерения поглощения на глубине 260 нанометров с кратчайшим интервалом считывания в течение 30 минут. Затем разморозьте все замороженные образцы на льду и разбавьте каждый размороженный образец 1x 10 PBS, предварительно нагретым до 37 градусов Цельсия в микроцентрифужных пробирках LoBind.
Чтобы приготовить пятимиллимолярный запас аденозина, добавьте 66,8 мг аденозина к 50 мл 1x PBS. Разбавив его до 250 микромолярного раствора, предварительно прогрейте аденозин до 37 градусов Цельсия в инкубаторе. В 96-луночный микропланшет, совместимый с ультрафиолетом, добавьте 160 микролитров аденозина, а затем по 40 микролитров каждого разведенного образца белка в трех количествах.
Измерьте поглощающую способность каждой лунки на 260 нанометрах в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия. Для анализа данных экспортируйте данные в электронную таблицу, а затем определите наклон линейной области данных поглощения в зависимости от времени в течение первых нескольких минут. Вычтите наклон отрицательного контроля, состоящего из объединенной человеческой сыворотки или PBS, из наклона смесей фермента и сыворотки и смеси фермента плюс PBS соответственно.
Наконец, нормализуйте все скорректированные наклоны до исходного наклона в момент нулевого часа, чтобы получить долю оставшейся активности с помощью уравнения, и постройте график зависимости оставшейся активности от времени. Активность HsADA1 дикого типа снижалась быстрее в объединенной сыворотке крови человека по сравнению с 1x PBS в течение пяти дней. Кривые снижения поглощения для HsADA1 дикого типа показали более крутой начальный наклон в нулевой день по сравнению с пятым днем.
Отрицательные контрольные образцы показали незначительное изменение абсорбции по сравнению с образцами ферментов.
