Для начала получим сорбит синхронизированной кольцевой стадией паразитов Plasmodium falciparum. Приготовьте 50 миллилитров 2x цитомикс буфера и разбавьте его 1 к 1 стерильной водой. Затем дважды промыть 100 микролитров осажденных кольцевых стадий эритроцитов 5 мл буфера 1X cytomix и центрифугировать их при температуре 994G в течение трех минут при комнатной температуре.
После удаления буфера добавьте в клетки по 50 микрограммов каждой плазмиды, а затем в соответствующий объем в 2 раза. Отрегулируйте объем до 400 микролитров с 1х буфером перед тем, как перелить приготовленный раствор в кюветы по 0,2 сантиметра для каждой трансфекции. Затем тщательно электропорируйте клетки.
После электропорации смешайте и инкубируйте клетки с полной средой RPMI в колбе T25 общим объемом 15 миллилитров. Далее центрифугируйте трансфицированных паразитов в конической пробирке объемом 50 миллилитров при температуре 994G в течение трех минут. После удаления надосадочной жидкости промыть паразитов 10 миллилитрами неполного РПМИ.
Культивируйте их свежими полными РПМИ в течение двух суток, пополняя среду через 24 часа. Через 48 часов извлеките полную RPMI из каждой колбы. Повторно суспендировать культуру в полном РПМИ с добавлением лекарственных препаратов.
Инкубируйте культуру в колбе Т75 вместе с 400 микролитрами свежих эритроцитов в течение двух недель. На 14-й день аквотируйте 200 микролитров трансфицированной культуры в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Центрифугируйте пробирку при температуре 500G в течение пяти минут при комнатной температуре. После аспирации надосадочной жидкости перенесите клетки на предметное стекло и поместите на него еще одно предметное стекло под углом 45 градусов, чтобы получился мазок.
После фиксации метанолом погрузите предметное стекло в морилку Гимзы на 20 минут. Промойте горку под проточной водой и тщательно просушите ее. Наблюдайте за предметным стеклом под световым микроскопом при 100-кратном увеличении после нанесения иммерсионного масла.
Как только паразиты будут визуализированы, пополняйте среду ежедневно в течение двух-трех дней.
