Предельное разведение для получения клональных трансгенных паразитов Plasmodium для борьбы с лекарственной устойчивостью при малярии

Для начала проверьте последовательность нужных генов, выделенных из обработанных лекарствами паразитов Plasmodium falciparum. После разбавления паразитированных эритроцитов добавьте соответствующий объем, чтобы получить в общей сложности 50 паразитов в 10 миллилитрах среды, обеспечивая 2%-ный гематокрит. Затем добавьте 100 микролитров этой среды, содержащей 50 паразитов, в каждую лунку 96-луночного планшета.

Поместите пластину в герметичный секадор, промытый газовой смесью. И инкубировать при 37 градусах Цельсия, пополняя среду каждые два дня. Заменяйте среду полным РПМИ, содержащим 2% гематокрита, каждый седьмой день до появления паразитов.

Наклоните 96-луночный планшет под углом 45 градусов, чтобы эритроциты успокоились. Осторожно удалите среду из каждой лунки с помощью многоканальной пипетки. Наблюдайте изменение цвета на желтый или темно-красный в лунках, содержащих паразитов, что контрастирует с розовым цветом среды в лунках, свободных от паразитов.

Далее выньте небольшое количество культуры из лунки, демонстрирующей изменение цвета, и приготовьте мазок на маркированном предметном стекле. После выполнения окрашивания по Гимзе понаблюдайте за предметным стеклом под микроскопом. Перелейте содержимое лунки, где были замечены паразиты, в колбу T25 и высиживайте, чтобы паразиты могли расти в течение четырех-пяти дней.

При достижении паразитемии от двух до 3% сапонин лизирует 500 микролитров культуры паразита. И извлечь генетический материал паразита.