Чтобы начать трансформацию клеток Escherichia coli BL21 DE3, разморозьте на льду 50 микролитров аликвоты компетентной клеточной суспензии. Добавьте один микролитр ДНК плазмиды pET 28a Sumo TRF2 в подходящую клеточную суспензию и аккуратно покрутите пробирку, чтобы перемешать суспензию. После трансформации распределите 100 микролитров клеточной суспензии на агаровой пластине luria bertani, или LB, содержащей 50 микрограммов канамицина на миллилитр.
Инкубируйте клетки в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. На следующий день выберите колонию трансформированных клеток и культивируйте ее в пяти миллилитрах LB-среды, дополненной 50 микрограммами на миллилитр канамицина. Инкубировать в течение 18 часов при температуре 37 градусов Цельсия, встряхивая при 220 об/мин.
После инкубации индуцируйте культуру с помощью одной миллимолярной ИПТГ в качестве конечной концентрации. Инкубируйте при температуре 20 градусов Цельсия в течение 17 часов, чтобы стимулировать экспрессию белка. Загрузите экстракты сырого белка вместе с буфером загрузки в гель SDS-PAGE.
Сначала проведите испытания при напряжении 100 вольт в течение 30 минут, а затем при напряжении 120 вольт в течение 50 минут в трисглициновом буфере. Затем покрасьте синим цветом кумасси, чтобы визуализировать экспрессию белка. Для очистки белка центрифугируйте экстракт сырого белка при 38 000 г в течение 40 минут при четырех градусах Цельсия и фильтруйте надосадочную жидкость через шприцевой фильтр 0,22 микрометра.
Загрузите отфильтрованную надосадочную жидкость в предварительно уравновешенный никелевый столбик в связующем буфере. Промойте колонку связующим буфером и разбавьте белок приготовленным имидазолом градиентом, собрав по 12 фракций по одному миллилитру каждая. Добавьте глицерин до конечной концентрации 50% к концентрированному и буферизованному белку для хранения.
Экспрессия TRF2 в Escherichia coli была успешно продемонстрирована, как показано в SDS-PAGE, где до и после индукции появлялись отчетливые полосы, соответствующие TRF2.
