Для начала нанесите пипеткой 1,5 миллилитра из 0,1 миллиграмма на миллилитр раствора йодида пропидиума в каждую лунку в электродной решетке. Поместите вставку в каждую лунку в электродной решетке, вставив ножки вставки в выравнивающие канавки так, чтобы вставка была заподлицо с верхней поверхностью лунки. Прикрутите печатную плату верхнего электрода к верхней части лунок электродной матрицы и подключите электродную решетку к устройству электропористой подложки, или PSEP.
Поместите электродную решетку в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия для выравнивания температуры. Нажмите на выпадающее меню рядом с мембраной в верхнем левом углу графического интерфейса и нажмите на 400 нанометровый GBO. В правой части графического интерфейса введите единицу в поле редактирования минуты времени после импульса.
Теперь нажмите кнопку «Запустить» и введите соответствующие имена для скважин с первой по третью и с четвертой по шестую. Затем нажмите «ОК», чтобы начать эксперимент. Через час извлеките электродную решетку из инкубатора и перенесите вставки обратно на исходные места в экспериментальной пластине.
Смешайте два микролитра Hoechst 33342 и пять микролитров кальцеина AM со 123 микролитрами среды для клеточных культур в пробирке объемом 200 микролитров. Аккуратно нанесите пипеткой по 10 микролитров раствора для окрашивания в каждый постимпульсный вкладыш и поместите вкладыши обратно в инкубатор на пять минут. Перенесите луночный планшет в держатель планшета флуоресцентного микроскопа с объективом 5-кратного увеличения.
Изображение с использованием светлого поля и флуоресценции каждого пятна. Пипеткой внесите 1,5 миллилитра среды для клеточных культур в каждую лунку в электродной решетке. Вставьте вкладыши для образцов ячеек в лунки с первого по третью, а контрольные вкладыши — в лунки с четвертого по шестой, устанавливая ножки вкладыша в выравнивающие канавки.
Прикрутите печатную плату верхнего электрода к верхней части лунок электродной решетки и подключите электродную решетку к устройству PSEP. Поместите электродную решетку в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия для выравнивания температуры. Нажмите на выпадающее меню рядом с мембраной в верхнем левом углу графического интерфейса и нажмите на 400 нанометровый GBO.
Теперь нажмите кнопку «Запустить» и введите соответствующие имена для скважин с первой по третью и с четвертой по шестую. Затем нажмите «ОК», чтобы начать эксперимент. Через час извлеките электродную решетку из инкубатора и перенесите вставки обратно на исходные места в пластине экспериментальной лунки.
После приготовления Hoechst 33342, кальцеина AM и йодида пропидиума в питательных средах для клеточных культур смешайте и осторожно нанесите пипеткой 10 микролитров раствора красителя в каждую вставку после импульса и поместите вкладыши обратно в инкубатор на пять минут. На флуоресцентном микроскопе изобразите вставленные образцы клеток с помощью светлого поля и флуоресценции каждого окрашивания. Оптимизированная здоровая кривая не показала падения ниже базового уровня и наибольший рост TEEI.
Визуализация клеточного монослоя после PSEP показала незначительную гибель клеток и здоровый полностью сливающийся клеточный монослой. Оптимизированные неработоспособные данные привели к снижению реакции TEEI. Визуализация после PSEP показала почти нулевую гибель клеток и снижение эффективности доставки из-за меньшего количества клеток в монослое.
Применение неоптимизированных форм сигнала привело к значительному снижению ответа TEEI, что указывает на значительную гибель клеток и снижение эффективности доставки.
