NGF доставлены в мозг является сложной задачей. Здесь мы представляем новый тип носителя, который позволяет безопасное и длительное высвобождение биоактивного белка. Этот метод позволяет просто и эффективно загружать NGF в пористые носители кремния.
Проводится при комнатной температуре и без использования прочных органических растворителей. По мере того как пористый конструкция несущей кремния настраивается несущие могут служить как имплантаты резервуара NGF для долгосрочного отпуска но могут также быть доработаны для того чтобы снести другие факторы и снадобья. Для инженеров и химиков процесс изготовления может быть проще в работе.
В то время как для жизни ученых и клиницистов, процедуры клеточной культуры должны быть относительно простыми для воспроизведения. Начните с установки одной точки пять на одну точку пять сантиметров кремниевой пластины с хорошо характерной резистенции в политетрафлеро эталина травления ячейки с использованием полосы алюминиевой фольги в качестве обратного контакта и о-кольцо для уплотнения клетки. Ткань является represistable для использования кремниевых пластин с аналогичными значениями резистентности каждый раз.
Электрохимически травления образца кремния в три к одному раствору akleus гидрофторной кислоты и этанола в течение 20 секунд при постоянной плотности тока 250 миллиампер на сантиметр в квадрате. Затем промыть поверхность полученной пористой кремниевой пленки этанолом три раза перед сушкой под потоком азота. Когда образец сухой, термически окисляют свежевытытый пористый образец кремния в трубчатой печи при температуре 800 градусов по Цельсию в течение одного часа в окружающем воздухе, чтобы сформировать окисленный пористый кремниевый эшафот.
Когда образец остынет, используйте dicing пилу, чтобы разрезать его на восемь на восемь миллиметров образца. Для загрузки образцов с NGF, обойтись 52 микролитров свежеприготовленного ngF погрузочного раствора поверх каждого образца и инкубировать образцы в течение двух часов при комнатной температуре в покрытые блюдо в условиях высокой влажности. Через два часа соберите раствор поверх образцов и разбавьте раствор для погрузки NGF и собранные образцы раствора после загрузки в соответствующий диапазон концентрации для комплекта iliza.
Когда все образцы были разбавлены, добавьте 100 микролитров разбавленных образцов в образцах кривой калибровки к каждому колодец антитела захвата NGF, покрытого 96 хорошо илиза пластины в течение двух часов инкубации при комнатной температуре. В конце инкубации, мыть пластину четыре раза и добавить сто микролитров одного микрограмма на миллилитр биотентилированных антител обнаружения к каждому хорошо в течение двух часов инкубации при комнатной температуре. После четырех моет, как попродемонстрировано добавить 100 микролитров Avidin-Horseradish Peroxidace к каждому хорошо в течение 30 минут инкубации при комнатной температуре, а затем четыре моет в буфер мытья, как попродемонстрировано.
После последней стирки добавьте 100 микролитров субстратного раствора к каждому колодец для 25-минутной инкубации цветовой гаммы при комнатной температуре. Затем используйте считыватель микроплатформ для измерения абсорбции на 405 нанометров с коррекцией длины волны, установленной на уровне 650 нанометров, и определения концентрации NGF как в погрузочном растворе, так и в собранном решении для загрузки на основе кривой калибровки. Для выпуска In Vitro NGF инкубировать NGF загружены окисленые пористые носители кремния в двух миллилитров нулевой точки нуля один моляр PBS дополнены один процент boyvine сыворотки альбаман в нулевой точке нулю два процента натрия азида при 37 градусов по Цельсию и 100 вращений в минуту орбитальной адъятации.
Соберите раствор каждые два дня, заменяя его двумя миллилитров свежего PBS после каждого стремления. Затем заморозить собранные образцы выброса в жидком азоте для хранения минус 20 градусов по Цельсию до ngF анализа илиза, как только что продемонстрировали. Для создания дифференцированной фео кромо ситома 12 или PC 12, культура клеток, собирать клеточной подвески путем sentripugation и повторно приостановить клетки в пять миллилитров свежей основной среды роста.
После второго sentribugation, повторно приостановить вкус в три миллилитров основной среды роста и использовать 23 калибровочный шприц, чтобы аспирировать клетки 10 раз, чтобы отделить любые кластеры клеток. После подсчета, семена один раз от 10 до четвертого клетки процентов в квадрате рабочей области на коллиген типа один покрытием пластин в присутствии дифференциации среды. Поместите тарелки в инкубатор.
Через 24 часа при 37 градусах Цельсия добавьте свежую бета-мурин NGF или NGF загруженную пористую кремниевую пластину к каждой пластине и верните пластины в инкубатор. Чтобы оценить жизнеспособность клеток, инкубировать культуры с 10 процентов соответствующего решения индикатора жизнеспособности в репрезентативных точках времени в течение пяти часов при 37 градусах по Цельсию и измерить поглощение на спектротропетометре на 490 нанометров с коррекцией длины волны, установленной на 630 нанометров. Для оценки дифференциации клеток PC 12 в присутствии NGF загруженных пористых носителей кремния, семян PC 12 клеток в 12 низких коллагеновых пластин покрыных в течение 24 часов в инкубаторе клеточной культуры и ввести ранее полученные In Vitro выпущенные образцы в соответствующие экспериментальные скважины.
После 24-часовой инкубации, изображение клеток с помощью световой микроскопии и вручную подсчитать количество клеток с алкронуритами в каждой хорошо. Для морфрометрического анализа дифференцированных клеток ПК 12 приобретают фазовое изображение культурных клеток в течение трех дней после обработки NGF и открывают файлы в нейроне J.Convert файл изображения в восьми битовом формате и используют планку масштаба изображения для измерения соотношения пикселей к микрометру. Используйте анализ и установить шкалу, чтобы установить шкалу и измерить длину каждого нейрита.
Затем вручную подсчитайте количество точек ветвления и количество нуритов, происходящих из каждой ячейки сомы. Показано высокое разрешение сканирующих электронных микроскопий изображений полученной окисленной пористой кремниевой пленки. Микрограф верхнего вида пленки показывает ее очень пористую природу с порами около 40 нанометров в диаметре.
Поперечный секционный микрограф расщепленной пленки показывает пористую толщину слоя в две точки девять микрометров, которая характеризуется взаимосвязанными цилиндрическими порами. Устойчивый выпуск NGF без эффекта всплеска достигается в течение одного месяца с более быстрым выпуском NGF в течение первой недели по сравнению с гораздо более медленными темпами выпуска в более поздние дни периода выпуска. Лечение с NGF загружены пористые носители кремния вызывает образование невритов в характерных разветвленных нейронных сетей в PC 12 клеточных культур.
Обратите внимание, что даже после 26 дней, выпущенный NGF вызывает дифференциацию клеток выше 50 процентов, указывая, что ngF захвата в пористой хозяина сохраняет биологическую активность белка в течение примерно одного месяца. Морфометрический анализ NGF загружены пористые кремниевые обработанные популяции клеток в дни один и три показывает, что PC 12 клетки, обработанные NGF загружены пористые кремния экспонат морфометрические значения, аналогичные тем, которые наблюдаются в контролируемых культурах лечения для всех трех параметров испытания. После и выполнения адекватно представленных шагов предоставит вам выгодную систему доставки NGF, способную поддерживать выживание и дифференциацию нейрональных клеток.
В настоящее время мы изучаем использование NGF пористых носителей кремния в качестве долгосрочного выпуска имплантатов в головном мозге, чтобы изучить их нормальный защитный эффект и знать дегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера. После этой процедуры, влияние NGF загружены пористые носители кремния на нормальный рост досальной древесины гангрены клетки также могут быть изучены. Пористый кремний является перспективным нано материал, который может быть использован для широкого спектра применений.
Кроме представленных здесь, включая биологические или химические датчики, диагностику и визуализацию. Чтобы исключить любую потенциальную токсичность пористых носителей кремния, к вашей клеточной линии, не забудьте выполнить эссе о разрыве и стерилизовать пористые образцы кремния.
