После выполнения сбора PLA dot для локализации взаимодействия белков откройте изображения из разных условий для настройки параметров для анализа в ImageJ. Определите и укажите эти параметры вместе с данными в макропрограмме. Чтобы удалить фон, нажмите «Обработать и вычесть фон».
Используйте функцию предварительного просмотра для проверки различных радиусов катящихся шариков. Для удаления шума нажмите «Обработать», «Шум» и «Удалить пятна». Затем нажмите «Обработать» и «Сгладить» в меню ядра, чтобы применить функцию сглаживания и улучшить заполнение.
Теперь нажмите «Изображение», затем «Тип» и выберите 8-битное для преобразования в 8-битное изображение. После этого отрегулируйте порог, перейдя в Изображение, Настройка и, наконец, Порог. Отрегулируйте порог, чтобы визуализировать все ядра или точки на изображении, избегая при этом перенасыщения и коллапса структур.
Также обратите внимание на значения и протестируйте на разных изображениях. Чтобы преобразовать в маску, нажмите «Обработать», «Двоичный» и «Преобразовать в маску». Для ядра щелкните Обработать, Двоичный и Заполнить отверстия, а затем Обработать, Двоичный и Водораздел.
Для точек PLA щелкните Процесс, Двоичный и Водораздел. Для подсчета ядер измерьте площадь или длину различных ядер, чтобы оценить средний размер. Используйте приблизительное значение для анализа частиц, нажав кнопку «Анализировать» и «Анализировать частицы».
Установите размер на 15 бесконечности и проверьте параметры. Показывать маску, отображать результаты, очищать результаты, добавлять в менеджер и исключать по краям. Чтобы подсчитать точки PLA, измерьте их площадь или радиус, чтобы оценить их средний размер.
Для каждого ROI в менеджере ROI нажмите в разделе «Анализ» и «Анализ частиц». Установите размер на 0.02 на 3. Отметьте параметры, поставьте маску, отобразите результаты, очистите результаты, суммируйте и исключите по краям.
Сохраните результаты, показывающие количество точек на ядро в каждом ядре, присутствующем на изображении. Взаимодействие Nek4 Ku70 увеличивалось в ядре после повреждения ДНК после 20 минут, одного часа и трех часов обработки этопозидом по сравнению с контрольными клетками и клетками, обработанными ДМСО. Лечение этопозидом значительно увеличивало взаимодействие топоизомеразы Nek5 2-бета по сравнению с контролем ДМСО.
Окрашивание гамма-H2AX увеличивалось после 20 минут обработки этопозидами и оставалось повышенным до трех часов, что указывает на устойчивую реакцию на повреждение ДНК.
