Для начала разрежьте металлические сетки на полосы размером 25 на 8 миллиметров. Поместите изготовленные по индивидуальному заказу сетки в контейнер для стерилизации и автоклавируйте на два часа. После автоклавирования поместите стерилизационный контейнер и флаконы объемом 1,8 миллилитра под стенд ламинарного потока.
Откройте емкость для стерилизации и снимите металлическую решетку. Вставьте сетку в крышку флакона объемом 1,8 миллилитра и закройте флакон. После сбора ткани коры яичников человека удалите мозговое вещество и разрежьте ткань желаемой формы.
Добавьте пять миллилитров раствора остеклования1 в первую лунку шестилуночного планшета. С помощью клеточного фильтра уравновесьте ткань коры яичников в течение пяти минут в лунке 1 пластины. Переместите клеточный фильтр с тканью коры головного мозга в лунку 2, содержащую пять миллилитров раствора витрификации 2, и уравновесьте в течение пяти минут.
Затем поместите ситечко, содержащее ткань коры головного мозга, в лунку 3 шестилуночного планшета, содержащего пять миллилитров раствора витрификации 3, на шесть минут. Заполните подготовленный криофлакон стерилизованным жидким азотом и поместите его в сосуд Дьюара, наполненный жидким азотом. Загрузите образцы тканей на металлическую сетку витрификатора в течение одной минуты.
Затем вставьте металлическую сетку в жидкий азот в криопробирку на основе сетки. Добавьте шесть миллилитров уравновешивающего раствора в лунку 1 стерильного шестилуночного планшета, затем переложите по шесть миллилитров RS в лунки 2 и 3. Выдерживать в течение одного часа при комнатной температуре.
Нагрейте раствор для быстрого нагрева в стерильном стакане для образцов в течение одного часа на нагревательной пластине, установленной при температуре 37 градусов Цельсия. Под стендом ламинарного потока откройте криоконсервированные флаконы, содержащие витрифицированную ткань коры яичников. Быстро переведите сетку в раствор для быстрого прогревания.
С помощью стерильных щипцов перенесите ткань в уравновешивающий раствор и выдержите в течение трех минут на качающемся шейкере. Затем промойте салфетку при комнатной температуре в течение 10 минут с RS1 и RS2 на качающемся шейкере. Растворите кальцеин в 100 микролитрах ДМСО.
Перелейте три микролитра кальцеина на дно 1,5-миллилитровой тубы и храните при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Добавьте 0,007 грамма коллагеназы в тубу объемом 1,5 миллилитра и храните пробирку при температуре минус 20 градусов Цельсия. Добавьте 997 микролитров DPBS к замороженным трем микролитрам кальцеина и повторно суспендируйте для растворения кальцеина.
Затем добавьте порошок холодной коллагеназы до получения 1000 микролитров рабочего раствора. Затем добавьте 500 микролитров рабочего раствора кальцеина и перенесите два кусочка по два миллиметра фрагментов коры яичников в лунки четырехлуночной чашки. Затем выдерживать в течение 90 минут при температуре 37 градусов по Цельсию, защищая от света.
Наконец, под помощью флуоресцентной микроскопии определяют жизнеспособность фолликулов.
