Витрификация ооцитов и согревающие процедуры необходимы для сохранения фертильности. Следование этому протоколу, как показано на рисунке, позволяет пользователю максимизировать эффективность этих процедур. Сохранение фертильности для витрификации ооцитов сегодня является устоявшимся и этически приемлемым подходом.
Это позволяет достичь эффективных и последовательных клинических результатов и преодолеть моральные и юридические ограничения, связанные с криоконсервацией эмбрионов. Для достижения мастерства в процессе витрификации важно ознакомиться со всеми критическими точками протокола, уделяя особое внимание времени воздействия образцов на криопротекторы. В течение 38 часов после извлечения и сразу после денудации пометьте все пластиковые материалы именем пациента, идентификатором и типом раствора и попросите свидетеля подтвердить информацию пациента о криоустройстве.
Когда все материалы будут помечены, осторожно перевертите каждый флакон ооцитов несколько раз, чтобы смешать и поместить 30-микролитровую каплю буферной среды HEPES, дополненную сывороточным альбумином человека и 30 микролитровую соседнюю каплю раствора равновесия на чашку Петри. Используйте пипетку стриппера, чтобы поместить ооциты в первую каплю и создать мост из среды к 30-микролитровой капле раствора равновесия для получения постепенного увеличения концентрации криопротекторов. Через три минуты добавьте вторую 30-микролитровую каплю раствора равновесия на пластину и используйте пипетку для создания среднего моста между каплями раствора.
Пока ооциты уравновешиваются, добавьте одну 30-микролитровую каплю раствора равновесия для каждого криоустройства, которое будет использоваться на пластине. Через три минуты переместите ооциты в чистый раствор равновесия в течение шести-девяти минут, чтобы позволить оооцитам вернуться к своему первоначальному размеру. Когда яйцеклетки восстановятся, приготовьте центральную лунку для ЭКО, содержащую один миллилитр раствора для витрификации.
Перенесите ооциты в тарелку в как можно меньшем месте и осторожно переместите их, чтобы удалить лишний раствор равновесия. Примерно за 10 секунд до окончания инкубации поместите криоустройство, помеченное информацией о пациенте, под микроскоп и отрегулируйте фокус на кончике криоустройства. Поместите ооциты на криоустройство рядом с наконечником в минимальном количестве раствора для витрификации и отодвиньте пипетку стриппера от ооцитов, чтобы удалить любой избыточный раствор витрификации, оставив ооциты покрытыми тонким слоем среды.
Быстро погружайте криоустройства в жидкий азот и быстро встряхивайте устройство, чтобы удалить пузырьки воздуха с его поверхности. Удерживая пинцетом защитный колпачок криоустройства, заполните колпачок жидким азотом перед введением устройства в колпачок, сохраняя при этом пропиленовые полоски в жидком азоте. Затем сохраните криоустройку в визотрубе, помеченной информацией о пациенте, и обновите лабораторный лист.
Для нагрева яйцеклеток осторожно переверняйте каждый флакон размораживания, разбавления и промывки раствора, нагретого до комнатной температуры, и добавьте один миллилитр оттаивающего раствора в центральный колодец чашки Петри для инкубации не менее одного часа при температуре 37 градусов Цельсия. Пометьте все пластиковые материалы с именем и идентификатором пациента и типом раствора и попросите свидетеля подтвердить информацию пациента на криоустройке. Для каждого устройства, которое будет нагреваться, добавьте 200 микролитров разбавляющего раствора в первую лунку шестиямесячной пластины и добавьте равный объем моющего раствора во вторую и третью лунки плиты.
Добавьте PBS в область на внешней стороне скважин, чтобы предотвратить испарение раствора. Поместите тарелку с раствором для оттаивания под стереомикроскоп и отрегулируйте фокусировку к центру тарелки. Осторожно закрутите, чтобы снять защитный колпачок криоустройства, сохраняя пропиленовые полоски в жидком азоте, и перенесите криоустройствитель из жидкого азота в раствор для оттаивания как можно быстрее, чтобы избежать риска девитрификации.
Через одну минуту сосредоточьтесь на кончике криоустройства, чтобы найти ооциты и в конечном итоге используйте пипетку стриппера, чтобы мягко освободить ооциты из устройства. Используйте пипетку стриппера диаметром 170 микрон для переноса ооцитов и небольшого объема оттаивающего раствора в разбавляющий раствор в первой скважине шестискваговочной пластины. Через три минуты переместите ооциты в первый колодец промывного раствора на пять минут.
В конце инкубации перенесите ооциты во вторую скважину промывочного раствора и высиживают при 37 градусах Цельсия в течение одной минуты перед переносом ооцитов в соответствующий объем предварительно уравновешенной культуральной среды ЭКО на один час и обновлением лабораторного листа. За 12-летний период 285 женщин подверглись по крайней мере одному извлечению ооцитов, влекущего за собой витрификацию всей когорты собранных зрелых яйцеклеток. Большинство из этих женщин подверглись однократному извлечению.
35 подверглись многократному извлечению. Причины для извлечения ооцитов для витрификации яйцеклеток обычно характеризовались как медицинские, отличные от рака, рака, немедицинские и другие. Пациенты с медицинской причиной витрификации яйцеклеток и пациенты, перенесшие сохранение фертильности из-за рака, были моложе и показали более высокое количество антральных фолликулов, чем пациенты с немедицинским или другими причинами.
Однако, поскольку средние показатели созревания были несколько ниже у пациентов с медицинскими причинами, количество оципированных ооцитов в среднем было одинаковым между группами. Примерно половина пациентов с медицинскими причинами, отличными от рака, и большинство пациентов с другими причинами витрификации яйцеклеток фактически вернулись для согревания. И наоборот, очень немногие пациенты, которые подверглись сохранению фертильности по причинам рака или немедицинских причин, использовали свои витрифицированные ооциты для ЭКО.
Несмотря на различия во времени, прошедшем между витрификацией и согревательностью, выживаемость ооцитов была одинаковой между группами пациентов, подтверждая эффективность и безопасность протоколов витрификации и согревания ооцитов. Более того, выживаемость не зависит от опыта оператора витрификации и нагрева. Наиболее важными шагами, которые могут повлиять на согласованность результатов, являются шаги, связанные с потеплением.
Поэтому очень важно тщательно контролировать объем и температуру размораживающих растворов. Криоконсервация ткани яичников является единственной стратегией, которая в настоящее время рассматривается в качестве варианта для препубертатных пациентов. Хотя этот подход и является многообещающим, он имеет важное ограничение, которое ограничивает его применение.
