Для начала достаньте флаконы FN-шелка из морозилки при температуре минус 80 градусов по Цельсию и поместите их в сухой лед для транспортировки. Поместите флаконы в шкаф биологической безопасности и поместите их в штатив для микроцентрифужных пробирок. После размораживания внесите пипеткой 550 микролитров шелкового раствора в каждую вторую лунку 48-луночного планшета.
Накройте тарелку крышкой и поместите ее в стерильную коробку. Осторожно перенесите коробку из шкафа биологической безопасности и оставьте ее в условиях окружающей среды на ночь. На следующий день принесите коробку с пластиной с пленками FN-silk и стерильными вставками в шкаф биологической безопасности.
Осторожно поднимите пластину из ящика, откройте крышку пластины и визуально убедитесь в образовании мембраны, наблюдая за помутнением в лунках. С помощью стерильного пинцета возьмите одну вставку и направьте ее вниз на мембрану до тех пор, пока ручки не коснутся верхней части лунки. После того, как все вкладыши будут опущены, накройте тарелку крышкой и верните тарелку в стерильную коробку.
Дайте мембранам прилипнуть к вставкам в течение двух часов. Далее достаньте тарелку из коробки и откройте крышку. С помощью стерильного пинцета извлеките вкладыш из лунки.
Заполните вкладыш 100 микролитрами DMEM/F12 для базального посева или 200 микролитрами для верхушечного посева. Переложите вкладыш в пустую лунку 24-луночного планшета и заполните лунку одним миллилитром DMEM/F12. После сбора желаемого количества кератиноцитов человека, с помощью пипетки P200 аспирируют от 20 до 50 микролитров клеточной суспензии.
Направьте наконечник пипетки к центру мембраны и медленно надавите на поршень пипетки, доводя каплю до контакта с питательной средой внутри вставки. После того, как все мембраны будут перенесены, переместите пластину в форме восьмерки, чтобы равномерно распределить клетки по мембранам. Инкубируйте культуру при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислом газе.
С помощью пинцета поднимите вкладыши из 24-луночного планшета, оставив питательную среду в лунках. Затем переверните вставку так, чтобы базальная сторона была обращена вверх. Поместите перевернутый вкладыш в чашку Петри.
Аспирируйте 20 микролитров суспензии ресуспендированных клеток кератиноцитов человека с помощью пипетки P200. Направьте кончик пипетки к центру мембраны и медленно нажимайте на поршень пипетки, чтобы образовалась капля, которая падает на мембрану. Накройте чашку Петри крышкой.
Перенесите чашку Петри и среднесодержащую 24-луночную пластину в инкубатор на 30 минут. После инкубации поместите 24-луночный планшет и чашку Петри в шкаф биологической безопасности. С помощью пинцета выберите одну вставку и переверните ее так, чтобы апикальная сторона мембраны была обращена вверх, а базальная – вниз.
С помощью пипетки P200 добавьте 200 микролитров питательной среды внутрь вкладыша. Поместите вставку обратно в предварительно заполненную лунку 24-луночного планшета. Закалывайте вкладыши при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.
Кератиноциты, культивируемые на мембране FN-шелка, равномерно покрывали поверхность и демонстрировали булыжную морфологию в первый день. Кератиноциты сформировали сливающийся слой к третьему дню, указывающий на эпителиальную функцию, и образовали сеть плотных соединений, указывающих на то, что они принимают физиологические эпителиальные функции. Высокая жизнеспособность клеток наблюдалась на мембранах FN-шелка через три дня, без существенной разницы в жизнеспособности между центром и периферией.
Мембранная система FN-silk поддерживает жизнеспособность кератиноцитов на уровне или лучше, чем коммерческие мембранные системы из ПЭТ.
