Агроинфильтрация листьев растений для изучения локализации плазмодесмального белка

Для начала вырастите семена Nicotiana benthamiana во влажной почве в контролируемой камере, установленной при температуре 23 градуса по Цельсию, выдерживая 16 часов света, а затем восемь часов темноты. После переноса двухнедельной рассады в горшки большего размера выращивайте растения в тех же условиях в течение четырех-пяти недель, чтобы подготовить их к экспериментам по агроинфильтрации. Нанесите Agrobacterium на клетки Mephasins EHA105, содержащие нужные векторы, на пластины LB агара и инкубируйте их при температуре 28 градусов Цельсия.

Через два дня переложите одну колонию из тарелки в два миллилитра бульона LB и инкубируйте в течение ночи при температуре 28 градусов Цельсия с перемешиванием со скоростью 250 оборотов в минуту. Затем удалите один миллилитр из ночной культуры и добавьте четыре миллилитра свежего бульона LB для повторной культуры на один час в тех же условиях. Гранулируйте клетки методом центрифугирования.

После этого определите количество клеток бактериальной суспензии на уровне 600 нанометров и отрегулируйте оптическую плотность до 0,1 или 0,2 с помощью инфильтрационного буфера. Инкубируйте бактериальную суспензию при комнатной температуре в течение трех часов при слабом перемешивании. Затем проникните в абаксиальную поверхность полностью раскрывшихся листьев с разных растений с помощью одноразового шприца объемом один миллилитр.

Отметьте инфильтрованный участок, который будет казаться темнее, чем окружающая неинфильтрированная ткань, водонепроницаемой ручкой.