Конфокальная микроскопия целевых белков для исследования плазмодесмальной локализации в агроинфильтрированных растениях

Для начала приобретите растение Nicotiana benthamiana, инфильтрированное клетками Agrobacterium tumefaciens, содержащими желаемые векторы. Для исследований локализации белка соберите два листа с двух растений в разные моменты времени после инфильтрации. С помощью лезвия разрежьте зону инфильтрации на дольки в сторону от жилы.

Поместите образец ткани абаксиальной стороной вверх на каплю стерильной воды в центре предметного стекла микроскопа. Накройте предметное стекло покровным стеклом, убедившись, что пузырьки не задерживаются. Визуализируйте флуоресцентный сигнал автофлуоресцентных меток в инфильтрируемой области с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа.

Соберите 20 изображений для каждого состояния, используя как минимум две независимые биологические реплики. Оценка плазмодесальной локализации испытуемого белка на основании диагностического точечного проявления сигнала на периферии клетки. Белки TVCV MP-EGFP и PDL5-EGFP продемонстрировали четкую точечную локализацию в плазмодесматах.

В то время как PDCB1-EGFP показал локализацию как в плазмодесматах, так и в эндоплазматическом ретикулуме в первый день, после инфильтрации. Как МП, так и PDLP5 начали накапливаться в плазмодесматах в первый день после инфильтрации, достигнув максимальной интенсивности на второй день и оставаясь стабильными в течение пяти дней. PDCB1 демонстрировал сильную эндоплазматическую локализацию ретикулума до третьего дня, после чего плазмодесмальная локализация стала заметной в меньшем количестве клеток.