Для начала покройте вкладыши Transwell 42 микролитрами 0,05% Matrigel. Инкубируйте в течение часа при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы Матригель застыл. Отсадите дополнительную среду и высушите Transwell в течение 30 минут без крышки.
Затем добавьте 200 микролитров среды DMEM F12 в каждую вставку и храните при температуре 37 градусов Цельсия до использования. Вымойте котлеты Matrigel, содержащие органоиды, с PBS. Подвергните их воздействию 500 микролитров восстановления клеток, находясь на льду, и многократно пипетируйте смесь, чтобы обеспечить полный сбор клеток в 15-миллилитровой пробирке.
Затем центрифугируйте пробирку при 300 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в целевом объеме эпителиальных стволовых клеток кишечника или среды IESC. Теперь предварительно помажьте одномиллилитровый шприц средой IESC, аспирируйте клеточную суспензию через иглу 16-го калибра.
Затем замените иглу 16-го калибра на иглу 28-го калибра и вытолкните суспензию, чтобы способствовать разделению органоидов. Далее поместите 200 микролитров полученной клеточной суспензии в апикальную сторону покрытых Трансвеллов. Добавьте 500 микролитров среды IESC и факторов роста в базальную сторону.
Используйте двухэлектродную измерительную камеру TEER для количественного определения TEER на монослоях. Заполните чашку для культуры 1,5 миллилитрами фильтрующего материала IESC и убедитесь, что во вкладыше Transwell присутствует ровно 200 микролитров фильтрующего материала, чтобы уровни жидкости совпадали во время измерения. Подвергайте базолатеральный аспект инсертов Transwell воздействию либо воспалительных цитокинов интерлейкина-1 бета, либо глиальных продуктов из культур, подвергшихся воздействию интерлейкина-1 бета.
Измеряйте TEER каждые 10–15 минут в течение 45 минут, помещая каждый Transwell в чашку для культуры. Базолатеральное воздействие сред из глиальных культур, обработанных 10 и 25 нанограммами интерлейкина-1 бета, значительно повышало проницаемость эпителиального барьера. Существенного увеличения проницаемости эпителия после воздействия лошадиного интерлейкина-6 в различных концентрациях не наблюдалось.
