Термострессовая обработка рассады арабидопсиса и подготовка градиента сахарозы для профилирования полисом и экстракции РНК

Для начала с помощью пипетки наберите 250 семян арабидопсиса для каждой группы состояний на фильтровальной бумаге, помещенной на агаровую пластину Мурашиге и Скуга Basal Media без сахарозы, с добавлением 1,2% фитоагара. Оберните тарелку алюминиевой фольгой, чтобы блокировать свет, и поместите ее в инкубатор при температуре четыре градуса Цельсия на два дня, чтобы вызвать яровизацию. Через два дня разверните фольгу и перенесите яровизированные семена в камеру роста.

Дайте растениям подрасти в течение пяти дней. Далее заклейте пластину, содержащую пятидневную рассаду, водонепроницаемым скотчем. Поместите пластину на водяную баню при температуре 40 градусов Цельсия на один час для обработки теплового стресса.

Сразу после термической обработки охладите пластину и перенесите ее в камеру роста, установленную при температуре 22 градуса Цельсия, на два часа, чтобы дать возможность восстановиться. Соберите 250 термически обработанных или необработанных саженцев в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров. Собранные образцы немедленно заморозьте в жидком азоте.

Приготовьте раствор градиента сахарозы с концентрациями 12,5%, 24,4%, 36,3%, 48,1% и 60%Чтобы приготовить прерывистый градиент плотности сахарозы, сначала загрузите 2,2 миллилитра 60%-ного раствора сахарозы на дно пробирки. Затем поместите пробирку в морозильную камеру при температуре 80 градусов Цельсия, чтобы заморозить раствор сахарозы до твердого состояния. После застывания загрузите по 2,2 миллилитра каждой из остальных концентраций сахарозы в ряду снизу вверх.

Храните приготовленный градиент сахарозы при температуре 80 градусов Цельсия до использования.