Этот протокол описывает, как создать полисомный профиль, который раскрывает молекулярные детали активности рибосом внутри клетки. Этот метод позволяет пользователям получать ценную информацию, предоставляемую полисомным профилем, которые не имеют доступа к автоматизированным системам фракционирования градиента. Не торопитесь при подготовке градиентов и храните их в месте, где они не будут нарушены компрессором или другими механическими операциями, когда они осядут в линейный градиент.
Для начала готовят стоковые растворы 7 и 47% сахарозы в буфере градиента сахарозы. Фильтр стерилизует растворы сахарозы через фильтр 0,22 мкм. Приготовьте 14 миллилитров 17, 27 и 37% растворов сахарозы, дозируя и смешивая 7 и 47% растворы.
Поместите шесть полипропиленовых центрифужных трубок в стойку для пробирок с полным обзором. Убедитесь, что между трубками достаточно места, чтобы действия с одной трубкой не мешали другим. Прикрепите девятидюймовую иглу 22 калибра с тупым наконечником к трехмиллилитровому шприцу и выполните тестовое заполнение и дозирование, чтобы убедиться, что шприц может удерживать раствор сахарозы без каких-либо капель перед установкой градиентов.
Добавьте два миллилитра 7%-ной сахарозы на дно каждой трубки центрифуги. Затем добавьте два миллилитра 17%-ной сахарозы под 7%-ным раствором, расположив наконечник иглы в непосредственной близости от дна трубки. Осторожно и медленно дозируйте раствор.
Повторите процедуру с двумя миллилитрами каждого из 27, 37 и 47% раствора сахарозы, убедившись, что каждый слой отличим от другого линией, обозначающей разделение плотностей. Храните градиенты при четырех градусах Цельсия в течение ночи, чтобы они осели в непрерывный, увеличивающийся процент сахарозы. После роста и сбора дрожжей, клеток Saccharomyces cerevisiae, повторно суспендируют клетки в охлажденные 700 микролитров буфера экстракции полисом.
Добавьте 100 единиц ингибитора РНКАЗы. Затем добавьте 400 микролитров предварительно охлажденных стеклянных шариков приблизительным размером от 425 до 600 микрон. Переложите смесь в 1,5-миллилитровую центрифужную трубку со стеклянными шариками и разрушайте дрожжевые клетки путем энергичного перемешивания в бисере-битере в течение пяти минут.
После разрушения клеток осветляют лизат центрифугированием. Определить концентрацию РНК в осветленном лизате, измерив абсорбцию на 260 нанометрах, используя систему обнаружения РНК на основе флуоресценции. Убедитесь, что концентрация РНК составляет от 0,5 до одного микрограмма на микролитр.
Если концентрация РНК слишком низкая, уменьшите объем экстракционного буфера, используемого для повторного суспендирования клеток. Осторожно загрузите лизат на верхнюю часть градиентов. Поместите наконечник пипетки к внутренней стенке в верхней части полипропиленовой трубки.
Наклоните трубку и медленно дозируйте лизат на верхнюю часть градиента, дриблингом прижимаясь к стене. Аккуратно поместите трубки в предварительно охлажденные ведра качающегося ротора ковша и центрифугируйте градиенты. После центрифугирования осторожно извлеките трубки центрифуги из качающегося ротора ковша и поместите их в держатель трубки.
Нанесите маркировку на 96-луночных пластинах для хранения фракций и предварительного охлаждения на льду. Соберите 100 или 200 микролитров фракций, начиная с верхней части градиента, осторожно вставив наконечник пипетки в верхнюю часть градиента и собирая фракции до тех пор, пока весь градиент не будет аликвотирован. Измерьте поглощение каждой фракции на 254 нанометра с помощью спектрофотометра против 7 и 47% растворов сахарозы в виде заготовок.
Создайте полисомный профиль, построив число фракций в сравнении с поглощением. Показаны три репрезентативных полисомных профиля из дрожжей S.Cerevisiae. Гребень каждой рибосомной субъединицы и полисомного пика виден на каждом профиле.
Репрезентативный профиль из автоматизированной системы фракционирования плотности показан здесь. Этот профиль был получен из непрерывного профиля поглощения, поскольку градиент сахарозы смещался снизу вверх раствором погони, через ячейку потока детектора и собирался в фракции. Здесь показан полисомный профиль, полученный путем ручного фракционирования 200 и 100 микролитров образцов.
Самое главное, что нужно помнить при этой процедуре, это не нарушать градиенты. Следите за тем, чтобы не вводить пузырьки воздуха или не нарушать градиент, дозируя раствор слишком быстро. После этой процедуры РНК может быть извлечена из градиентов для дальнейшего анализа для определения мРНК, которые связаны с активными рибосомами.
