Для начала соберите замороженную и необработанную пятидневную рассаду Columbia-0 Arabidopsis в контейнер с жидким азотом. Измельчите рассаду с помощью гомогенизатора в порошок в течение одной минуты. Затем добавьте в пробирку 500 микролитров буфера для экстракции полисом.
Переверните и закрутите пробирку, чтобы перемешать образец. Центрифугируйте экстракционный раствор при 12 000 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Затем отфильтруйте надосадочную жидкость через клеточное сетчатое фильтр с плотностью 100 микрометров, чтобы получить прозрачный раствор для экстракции без частиц.
Загрузите отфильтрованную надосадочную жидкость на заранее подготовленный градиент сахарозы и подождите, пока он достигнет равновесия. Затем ультрацентрифугируйте градиент с помощью качающегося ротора при 210 000 G в течение 3,5 часов при четырех градусах Цельсия с максимальными темпами ускорения и замедления. Неполисомальные и полисомальные РНК разделяются в зависимости от их плотности в соответствующем растворе градиента сахарозы.
Приготовьте раствор для микрообъемного шприцевого насоса, состоящего на 70% сахарозы, 10% глицерина и 0,02% бромфенолового синего. Тщательно перемешайте раствор в течение 30-40 минут. После введения чеканного раствора в градиент, с помощью программного обеспечения, управляйте фракционатором градиента плотности.
Затем откалибруйте машину с помощью деионизированной воды. После ультрацентрифугирования поместите пробирку на фракционатор градиента плотности. С помощью системы прокалывания трубки подключите трубку к шприцевому насосу и ультрафиолетовому детектору.
Переключите фракционатор плотности в программный режим дистанционного управления. Установите скорость впрыска микрообъемного шприцевого насоса на три миллилитра в минуту. Начните процесс получения графа профиля полисом, измерив оптическую плотность на глубине 254 нанометра с помощью фракционатора.
На основе измерений профиля полисом соберите отдельно фракции неполисомальной и полисомальной РНК. Тщательно перемешайте собранные фракции РНК с предварительно холодным двукратным раствором с высоким содержанием соли. Затем добавьте восемь микролитров разведенного запаса эукариотического поли-А РНК контроля из набора.
Центрифугируйте смешанную РНК с высоким содержанием солей с помощью качающегося ротора ведра при 450 000G в течение пяти часов при четырех градусах Цельсия. Осторожно слейте надосадочную жидкость и трижды промойте гранулу РНК 500 микролитрами предварительно холодной воды, обработанной DEPC. После последней промывки добавьте в образец РНК 500 микролитров реагента для экстракции РНК.
Перемешайте и выдержите в течение 10 минут. Добавьте 100 микролитров хлороформа и тщательно перемешайте. Инкубируйте в течение 10 минут, чтобы обеспечить разделение фаз.
Центрифугируйте смесь при 12 000 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Перенесите верхний прозрачный водный слой, содержащий РНК, в новую пробирку и аккуратно смешайте его с равным объемом изопропанола. Инкубируйте смесь при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение двух часов, чтобы выпасть в осадок РНК.
После осаждения снова центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость, оставив гранулу РНК на дне. Промойте гранулу РНК одним миллилитром предварительно холодного 75%-ного этанола. Центрифугируйте при 12 000G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и высушите гранулу РНК на воздухе.
После высыхания повторно суспендируйте гранулу в 30 микролитрах воды, обработанной DEPC. Измерьте концентрацию РНК с помощью спектрофотометра полного спектра на частоте от 220 до 750 нанометров, сосредоточившись на оптической плотности на высоте 260. Полисомное профилирование показало отчетливое разделение между неполисомальными и полисомальными фракциями в нормальных условиях.
Тепловой стресс при 40 градусах Цельсия значительно снижал интенсивность сигнала полисомальной фракции, и этот эффект был обращен вспять после двухчасового восстановления при 22 градусах Цельсия, в результате чего сигнал вернулся к контрольному уровню. Результаты экстракции РНК показали, что тепловой стресс снижает процент РНК в полисомальной фракции, которая восстанавливается после восстановления при 22 градусах Цельсия.
