Обработка ткани яичников и определение овариального резерва у молодых женщин с помощью анализа плотности фолликулов по Z-шкале

Для начала соберите ткань яичника из операционной после биопсии в пробирку, содержащую пять миллилитров дополненного 1X DPBS. С помощью стерильного скальпеля отрежьте от поверхности яичника небольшой кусочек ткани яичника размером около двух миллиметров. Затем погрузите ткань в 350 микролитров раствора Буэна при комнатной температуре на два часа.

После инкубации промойте ткань с 70%-ным этанолом три раза. После встраивания и разрезания тканей проводят окрашивание гематоксилином и эозином и получают цифровые изображения для анализа. Откройте файлы с помощью соответствующего программного обеспечения, такого как QuPath.

Перетащите файл в главное окно QuPath и установите тип изображения Brightfield H&E. Определите эпителий поверхности на расстоянии одного миллиметра с помощью масштабной линейки. Нажмите на инструмент «Эллипс» и аннотируйте фолликулы.

Подсчитайте количество фолликулов в пределах этой области размером в один миллиметр от первичной до первичной стадии созревания. Введите идентификатор образца, возраст, количество фолликулов для каждого предметного стекла, толщину среза и N подсчитанных сечений в лист под названием «Фолликул в миллиметровом кубе» в файле Follicle Z-Score Calculator Excel. После определения наибольших 10% фолликулов в каждом подсчитанном участке нажмите на инструмент «Линия» и проведите две перпендикулярные линии через мембрану ооцита.

Выберите «Измерить», затем нажмите «Показать измерения аннотации», чтобы определить средний диаметр этих ооцитов. Запишите измерения под столбцом с надписью length в микрометрах. Введите средний диаметр ооцитов самых больших 10%-ных фолликулов в микрометрах для каждого предметного стекла в файле Follicle Z-Score Calculator Excel.

Поместите изображение в центр экрана в QuPath и нажмите на иконку ImageJ. Затем выберите Отправить снимок в ImageJ. В ImageJ разграничьте границу на один миллиметр с помощью инструмента «Кисть» и нажмите на «Изображение», затем «Тип» и выберите 8-битный.

Далее нажмите на инструмент «Линия» и нарисуйте линию на масштабной линейке. Выберите «Анализ», затем «Установить масштаб», введите длину, указанную на масштабной линейке в поле «Известное расстояние», и нажмите «ОК». Затем нажмите на «Изображение», затем отрегулируйте яркость/контрастность и выберите «Авто». Теперь нажмите на Изображение, затем настройте Порог и выберите Авто.

Нажмите на инструмент «Палочка», выберите область, а затем нажмите Ctrl M. Введите значение площади в файл Follicle Z-Score Calculator Excel. После того, как все данные сведены в таблицу в файле Follicle Z-Score Calculator Excel, перейдите к листу под названием Z-Score Follicle Per Millimeter Cube в том же файле Excel, чтобы определить, есть ли сниженный овариальный резерв. Поверхностный эпителий яичника ребенка был хорошо виден, а овариальный резерв находился под ним после процедуры окрашивания.

Плотность фолликулов использовалась для расчета Z-баллов овариального резерва, при этом Z-критерий менее отрицательных 1,7 указывает на снижение овариального резерва.