Генотипирование трансгенных растений и заготовка семян для селекции сортов риса, обогащенных устойчивым крахмалом

Для начала получите SG РНК и трансформируйте агробактерию с ДНК плазмы. Пересадите трансгенные растения в горшки и выращивайте их в течение одного месяца в теплице. Чтобы определить тип мутации, соберите от двух до трех миллиграммов свежих листьев с каждого куста одного саженца в качестве одного образца, используя установленные протоколы.

Извлеките геномную ДНК из собранных образцов листьев. Спроектируйте ПЦР-праймеры для амплификации области гена SBEIIb, окружающей сайт-мишень с одной направляющей РНК, чтобы получить амплифицированный фрагмент длиной 493 пары оснований. Секвенируйте фрагменты ПЦР непосредственно с помощью метода Сэнгера для выявления мутаций.

Выберите линии E0, демонстрирующие гомозиготные мутации сдвига рамки отсчета, и посадите их в теплицу для получения семян. Затем соберите листья двухнедельных саженцев и извлеките геномную ДНК растения. Проведите геномную ПЦР с помощью соответствующей программы для выявления наличия гигромицина, UBI и Cascoset в геноме растения.

Проанализируйте продукты ПЦР с помощью гель-электрофореза, чтобы выявить линии, которые не имеют полос, указывающих на то, что они являются линиями Е1 без трансгенов. Соберите семена с этих выбранных линий. Мутантные растения демонстрировали полностью непрозрачный, восковой вид в своих зернах, в отличие от полупрозрачного вида зерен дикого типа.

Существенных различий между мутантами SBEIIb и растениями дикого типа по норме завязывания семян, количеству зерен в метелке и урожайности с растения не наблюдалось.