Для начала соберите семена мутантных растений и растений X134 и дайте им высохнуть естественным образом при комнатной температуре, пока содержание влаги не достигнет примерно от 13 до 15%. После активации машины для очистки введите 10 г рисовых зерен в кормушку, чтобы эффективно удалить оболочку клевы. Переложите очищенные семена риса в рисовую мельницу и включите машину в течение 60 секунд, чтобы удалить слой алейрона, дающий шлифованный рис. Далее поместите шлифованный рис в тканевую мельницу.
Отрегулируйте частоту помола на 60 Гц и запустите кофемолку в течение 15 секунд в течение двух циклов, чтобы получить рисовый порошок. Положите молотый рисовый порошок в чашку Петри и поставьте в разогретую духовку, установленную на 37 C, на 12 часов. Затем добавьте 100 мг рисового порошка в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл и осторожно постучите по пробирке.
Добавьте в пробирку 180 л очищенной воды и прокипятите образец на водяной бане в течение 20 минут. После того как образец остынет, введите в пробирку 4 мл АМГ, содержащей альфа-амилазу поджелудочной железы. Далее смешайте содержимое на вихревом осцилляторе, и инкубируйте пробирку при температуре 37 С в течение 16 часов при непрерывном перемешивании.
Теперь добавьте 4 мл этанола и перемешайте образец с помощью вихря. Затем центрифугируйте пробирку при 1,500 G в течение 10 минут. После сцеживания надосадочной жидкости добавьте в пробирку 2 мл 50% этанола, а затем 6 мл 50% IMS и перемешайте.
После центрифугирования трубки осторожно слейте надосадочную жидкость и переверните трубку для слива лишней жидкости. Поместив пробирку на ледяную баню, добавьте в нее 2 мл 2 моляра гидроксида калия, и помешивайте образец в течение 20 минут для повторного суспендирования флока и растворения резистентного крахмала. Добавьте в пробирку 8 мл 1,2 молярного буфера ацетата натрия, отрегулированного до pH 3,8, и перемешайте с помощью магнитной мешалки.
Затем сразу же введите в смесь 0,1 мл АМГ и тщательно перемешайте. Инкубировать образец в течение 30 минут при 50 С на водяной бане с прерывистым перемешиванием с помощью вихря. После инкубации центрифугируйте пробирку при 1 500 G в течение 10 минут.
Теперь перенесите 0,1 мл надосадочной жидкости в свежую стеклянную пробирку. Добавьте 3 мл реагента на основе глюкозооксидазыпероксидазы и инкубируйте образец при температуре 50 °С в течение 20 минут. Тщательно пипетируйте 200 л каждого пустого раствора образца и стандартного раствора в 96-луночный планшет.
Измерьте абсорбцию каждого образца при 510 нм по отношению к холостому раствору и рассчитайте содержание стойкого крахмала по формуле. Наконец, дайте участникам 50 г готового риса с 200 мл воды. После еды соберите образцы венозной крови в разные моменты времени для проведения анализа уровня глюкозы в крови.
Содержание резистентного крахмала было достоверно выше у мутанта SBEIIb на 5,2% по сравнению с диким типом. Употребление приготовленного риса приводило к замедлению и снижению реакции глюкозы через 15 и 30 минут со снижением на 9,7% и 3,7% соответственно.
