Эта работа была поддержана Burroughs Wellcome Карьера премии в области медико-биологических наук (АКМ), Уайтхолл исследовательского фонда Грант (АКМ), Слоан стипендии Фонда (АКМ), NIH EY019277 (АКМ) и НОУ финансируется, Видение Обучение Грант, EY013319 ( ЕАК).

<ol><li> Для визуализации нейронов в интактном мозге при помощи двух-фотонной микроскопии, подготовка которых нейроны помечены флуоресцентными маркерами используется. В экспериментах, представленные здесь мы используем GFP-М трансгенных мышей линии, которая этикетки слой 5 пирамидальные клетки 1. Уровень 5 пирамидальные клетки проекта дендритные процессы в поверхностных слоях, что позволяет визуализации дендритов и дендритных шипиков на глубину до 300 мкм ниже уровня Пиа. Альтернативный подход заключается в этикетке клеток с использованием вирусных маркеров (см. Лоури и соавт., Представленный на Юпитер). </li><li> Стерилизовать рабочей области, используя 70% этанола и автоклава инструменты для асептической хирургии. Крышка рабочей поверхности чистой повязки. </li><li> Обезболить мышей с Фентанил коктейль (фентанил 0,05 мг / кг, мидазолам 5 мг / кг; metatomadin 0,5 мг / кг), а затем на четверть дозы Avertin (0,0075 мг / мл), используя IACUC утвержденными процедурами. Предварительной обработки мышей с обезболивающим, бупренорфин (0,5 мг / кг) подкожно (SQ). Монитор уровня плоскости анестезии, проверяя реакцию на хвост / ног крайнем случае. </li><li> Поддерживать животных на 37,5 ° С с использованием нагрева одеяло с прикрепленными ректального термометра. </li><li> Применение глазной мази для глаз, чтобы предотвратить глаз от высыхания. Худа глаза с небольшими лист бумаги, чтобы защитить глаза от источника света во время операции. </li><li> Использование ножницы, удалить волосы из задней части головы (за ушами), чтобы глаза. </li><li> Чистая верхней части головы животного с последовательным применением 70% этанола, а затем скраб бетадин и бетадин решение. </li><li> Сделать L-вырезать разрез за ушами и вдоль правой или левой стороны от средней линии (в зависимости от полушария будут в образ), чтобы глаза. Сложите кожу над и далеко от хирургии сайта. Не снимайте кожу, как кожа будет зашивается следующих изображений сессии. </li><li> Использование тонких щипцов осторожно потяните кожу вверх и в сторону от вашей области интересов. </li><li> Аккуратно соскрести надкостницы от пораженном участке черепа чистой щипцов или микрохирургических лезвия. Использование ватным тампоном, нанесите небольшое количество на 10% хлорида железа к черепу, чтобы полностью высохнуть надкостницы мембраны и убедитесь, что она была удалена полностью. Важно, что череп полностью высохнет для обеспечения надлежащего склеивание клеем (см. 11). Использование щипцов или микрохирургические лезвия, осторожно соскрести сухой надкостницы мембраны. </li><li> Нанесите тонкий слой клея цианоакрилат вокруг изображения окна пластиной из нержавеющей стали головой (см. Рисунок 1) и прикрепить пластину к черепу. </li><li> Использование деревянных конце хлопка тампон, палки, нанесите клей на швы внутри изображения окна, убедившись, чтобы заполнить все пробелы между пластиной с изображениями и кривизны черепа. </li><li> Место каплю клея ускорителя в окно. Быстро вытереть избыточного ускоритель клея с помощью ватного тампона или Ким салфеткой. Клей должен быть полностью затвердевших до сверления. </li><li> Начать тонкий череп в изображение окна с помощью бормашины заверенные 0,7 мм из нержавеющей стали заусенцев. Альтернативные бурения с редкими применения 0,9% стерильного физиологического раствора, чтобы избежать создания слишком много тепла, на черепе. </li><li> Тонкие окна 4х4 мм на черепе с помощью небольших ударов по всей поверхности черепа с бормашины. Испытание тонкость череп с тупого конца пинцетом. Поверхности черепа будет отступа немного с легким нажимом. Оптимальная толщина для работы с изображениями черепа составляет от 10 до 30 мкм. </li><li> Когда череп тонкий и окна очистить от всех мусора, место солевой на черепе. Фотографии изображений окно с цифровой камеры, установленной на вскрытии области. Фотография и использование мозга сосудистой поможет в поиске позиции для размещения изображений пластина для последующих сессий визуализации. </li><li> Транспорт животным 2-фотон буровой установки. Животное должно оставаться на обогрев одеяло (с зондом ректальной) в течение всего сеанса визуализации. Обратите внимание: в то время под действием успокоительного, составляющего ядро ​​животного температура будет колебаться значительно, в отсутствие нагревательного элемента в результате повреждения или коры, возможно, смерть. </li><li> Двухфотонного микроскопа с Mai Tai лазер, 10W твердом состоянии насос для максимальной мощности и изменение Olympus Fluoview конфокальной устройство используется. Система оптимизирована для глубокого изображения тканей и внешних детекторов установлены как можно ближе к цели, как можно разрешить максимального обнаружения флуоресценции от мозга. Olympus FL LUMPlan / IR 20X/0.95NA объектива используется. 0,9% физиологического раствора используется во время съемки для целей погружения. </li><li> С помощью этого микроскопа, и низкий цифрового зума (x1) определить области, содержащей ярко меченых нейронов. </li><li> Использование цифровой камеры, прикрепленной к глазу кусок микроскоп, сфотографировать изображение области. Кроме того, обрисовать картину крови сосудов. Это необходимо для повторногосвою очередь, в той же папке изображений с последующей временной точке. </li><li> Получить низким стек увеличением (х20 цели, 512x512 пикселей, 5 мкм, шаг) через весь видимый масштаб мозга (как правило, охватывает около 200 мкм), показывающие степень дендритные ветвления. Примечание: это низкое увеличение изображения будет использоваться для поиска изображений область в последующие моменты времени, как и кровеносные сосуды и дендриты сохранить свою структуру в молодых и взрослых животных. </li><li> Использование для обработки изображений (Fluoview, v. 5.0, FV300), повышение цифровым увеличением в 8 раз. Настройка X, Y координаты (панорамирование координаты) в случае необходимости и собрать высокий стек увеличение, которое покажет подробную дендритных морфологии в том числе мест и структуры дендритных шипиков. Возьмите подробные записи о каждом стеке сбора, то есть кастрюля координаты, диапазон сбора, Z-шаг размер и количество шагов в свой стек. Эти записи будут использоваться при возвращении к этому дендрита или аксона в последующие момент времени. </li><li> После обработки изображений, удалить голову пластину, аккуратно разделяющей пластины от поверхности черепа. Использование щипцов, удалить остатки клея, оставшиеся на черепе и протрите поверхности черепа с 0,9% стерильного физиологического раствора. Шовный кожу над черепом вместе, используя # 6 сшивания потока. Протрите область с 70% этанола. Чтобы облегчить боль во время послеоперационной реабилитации, администрирования 0,1 мг / кг Бупренорфин болеутоляющее, SQ. </li><li> Место животных в чистой клетке под лампой тепло, пока он не проснется и мобилен. Вернуться животное оригинальной клетки. </li><li> Для Reimage животных на более позднем этапе (наши точки изображения времени может быть от 2 дней до нескольких месяцев друг от друга), удалите стежки или возобновить кожу на голове с использованием асептических методов, что и выше. Использование цифрового изображения головного мозга сосудистой (взято на первом свидании хирургии), чтобы найти исходное расположение изображения. Reaffix нержавеющей стали headplate (шаги 10-12). Использование микрохирургической лезвием аккуратно тонкую далеко любые кости, которые могли быть повторно вырос между точками изображения времени. В случае необходимости, с тонкими бормашины. Прозрачное окно изображения от мусора и применять капли 0,9% стерильного физиологического раствора. </li><li> Carry животное двухфотонного микроскопа и найти исходное поле изображения. Использование цифровой фотографии, сделанной во время первой сессии изображений для получения помощи. </li><li> Открытое Fluoview программу и открыть исходный низкий увеличения изображения. Прикрепите прозрачности листа на экран компьютера и эскиз картины основных кровеносных сосудов использованием прозрачности пера. </li><li> Открытое Изображение в реальном времени и перестроить крови к сосудистой набросал рисунок на прозрачной пленке. </li><li> Для Reimage 8x увеличено структур, откройте желаемый собраны стек от предыдущей сессии изображений. Очерк структуры (т.е. аксонального, дендритные, глиальные) на прозрачной пленке, прикрепленной к экрану компьютера. </li><li> Увеличить 8x от живого изображения и установить кастрюлю координаты первые параметры визуализации день. В зависимости от точности выравнивания низкое расположение увеличение, это может быть необходимо также отрегулировать угол изображения незначительно. Как только желаемую структуру найден, совпадают структуру вашего рисовал картины высоких увеличениях. Сбор Z-Stack с одинаковым размером шага и номер Z-Stack изображения для последующего анализа. </li><li> Повторите шаги 29 и 30, пока все изображения с высоким увеличением повторно собираются. </li><li> При визуализации завершена, повторите шаги 22-24. Re-изображений может быть повторен на скорости до 2 отдельные моменты времени. </li><li> Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными Виварий и отдела лабораторных животных медицины Университета Рочестера школы медицины и стоматологии, в полной аккредитации Ассоциации оценке и аккредитации лаборатории по Уходу за животными, International (AAALAC) и в соответствии с государственным законом, федеральным законом и NIH политики. </li></ol> Представитель Результаты В GFP-М выразив мышей, подмножество слоя 5 пирамидальные клетки и соответствующие дендритные процессы могут быть легко визуализированы с помощью 2-фотонный лазерной сканирующей микроскопии (2PLSM) 1. Здесь мы показали в разреженных черепа подготовки, в которой череп желаемое расположение изображений сокращается до ~ 10-30 мкм. Выполнены правильно, наш протокол позволил четко визуализировать корковых дендритов и шипы в интактном зрительную кору острой или хронической анализа (рис. 2). <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1. Custom голова и опорной плиты. () Вид сверху на заказ голова и основание для разреженных черепа операции подготовки. (B) Вид сбоку на заказ голову и опорной плиты. (C, D) Подробные схемы и изображение головы пластинку. <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig2.jpg" alt="Рисунок 2" /> <stroнг&gt; Рисунок 2. Представитель результаты 2PLSM следующие подготовки тонких черепа. () Дендриты отображается в естественных условиях в зрительной коре трансгенных GFP-М мыши с помощью двух-фотонной микроскопии. Изображение является проекцией одного изображения, полученного через каждые 5 мкм от мягкой до конечной глубине 175 мкм. Коробках область в увеличенном представляет регион в (Б) и (С) отображается на день 0 (D0) и четыре дня спустя (D4). (D, E) Высшее увеличение дендритные ветви загнала вас в угол В и С демонстрируют стабильный шипами (белые наконечники стрел), потеряли / сворачивания шипами (красный наконечники стрел) и новые шипы (руководители зеленая стрелка). Шкала баров = А. 200 мкм, B, C. 20 мкм, D, Е. 5 мкм.

<ol>
	<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li><li>Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Majewska, A. K., Newton, J. R., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+synaptic+structure+in+sensory+cortical+areas+in+vivo.">Remodeling of synaptic structure in sensory cortical areas in vivo.</a> J Neurosci. 26 (11), 3021-3029 (2006).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging.">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).</li><li>Xu, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex.">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Хронический визуализации с использованием двухфотонного микроскопии становится все более популярной техникой для изучения морфологических изменений, вызванных в течение 2-5 пластичности. Здесь мы показываем, в разреженных черепа подготовки следовать определены дендритных шип...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fentanyl Citrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; 
IP Dose: 0.0125 ml/g
 Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg</td>
</tr>
<tr>
<td>Medetomindine Hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; 
IP Dose: 0.0125 ml/g
 Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg</td>
</tr>
<tr>
<td>Midazolam HCL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fentanyl Cocktail: Anesthesic Cocktail; 
IP Dose: 0.0125 ml/g
 Final cocktail conc.: 0.05 mg/kg</td>
</tr>
<tr>
<td>2,2,2-tribromoethanol </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avertin Cocktail: Anesthetic; 
IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: 1%
</td>
</tr>
<tr>
<td>2-methyl-2-butanol (Final concentration: 0.775%)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avertin Cocktail: Anesthetic; 
IP Dose: 0.0075 cc/ g Final cocktail conc.: .775%
</td>
</tr>
<tr>
<td>TC-1000 Temp. Control System for Mice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>CWE, Inc.</td>
<td>TC-1000 Mouse</td>
<td>Body Temp. Regulation</td>
</tr>
<tr>
<td>Toberadex</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>In-house pharmacy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eye Ointment</td>
</tr>
<tr>
<td>10% Ferric Chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ricca Chemical, Inc.</td>
<td>3120-32</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Microsurgical Blade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sable Industries</td>
<td>S-6400</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Cyanoacrylate 404,401</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Loctite</td>
<td>P/N 46551</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Cyanoacrylate 401</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Loctite</td>
<td>P/N 40140</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Zip Kicker Glue Accelerator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pacer Technology</td>
<td>PT-29</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>19008-07</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>Microtorque Control Box and Tech2000 Handpiece</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ram Products, Inc.</td>
<td>TECH2000ON/OFF</td>
<td>Thin-skull preparation</td>
</tr>
<tr>
<td>#6-0 (0.7 metric ) silk suture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ethicon</td>
<td>K8894H</td>
<td>Taper C-1</td>
</tr>
<tr>
<td>Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved</td>
<td>Surgical Tools</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11152-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm</td>
<td>Surgical Tools</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14084-08</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm</td>
<td>Surgical Tools</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11000-12</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

chronic imaging of mouse visual cortex using a thinned-skull preparation

В естественных изображений с помощью двух-фотонной микроскопии лазерного сканирования (2PLSM) позволяет изучения живых клеток и нейронов процессов в интактном мозге. Техники, представленные здесь позволяет изображений одного и того же область мозга, в нескольких точках времени (хронический изображений) с микроскопическими разрешение позволяет отслеживания дендритных шипиков, которые являются мелкими структурами, которые представляют большинство возбуждающих постсинаптических сайтов в ЦНС. Способность четко решать штраф корковых структур в течение нескольких моментов времени имеет много преимуществ, в частности, в изучении пластичности мозга, в которых морфологические изменения в синапсах и схема реконструкции может помочь объяснить основные механизмы. В этом материале видео и дополнительные, мы показываем протокол для хронических в естественных изображений нетронутыми мозга с помощью разбавленной-череп подготовки. В разреженных черепа препарата минимально инвазивных подход, который позволяет избежать потенциального повреждения твердой мозговой оболочки и / или коры, снижая тем самым начало воспалительного ответа. При этом протокол выполняется правильно, то можно четко отслеживать изменения в характеристики дендритных позвоночника в интактном мозге в течение длительного периода времени.

Watch this Scientific Journal Video about Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation at JoVE.com

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

В этом материале видео и дополнительные, мы показываем протокол для хронических<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Визуализации нетронутыми мозга с помощью разбавленной-череп подготовки.

Хронический изображений Мыши зрительной коры Использование тоньше черепа-подготовка

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

chronic-imaging-mouse-visual-cortex-using-thinned-skull

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K Views.  University of Rochester. В этом материале видео и дополнительные, мы показываем протокол для хронических В естественных условиях Визуализации нетронутыми мозга с помощью разбавленной-череп подготовки.

Video: Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Несколько мыши нейроанатомической Магнитно-резонансная томография

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that break away from axon terminals when the cortical tissue is homogenized. The SNs retain pre- and postsynaptic characteristics, which makes them useful in the study of synaptic transmission. They retain the molecular machinery used in neuronal signaling and are capable of uptake, storage, and release of neurotransmitters.
The production and isolation of active SNs can be problematic using medias like Ficoll, which can be cytotoxic and require extended centrifugation due to high density, and filtration and centrifugation methods, which can result in low activity due to mechanical damage of the SNs. However, the use of discontinuous Percoll-sucrose density gradients to isolate SNs provides a rapid method to produce good yields of translationally active SNs. The Percoll-sucrose gradient method is quick and gentle as it employs isotonic conditions, has fewer and shorter centrifugation spins and avoids centrifugation steps that pellet SNs and cause mechanical damage.

A method to prepare translationally active, intact synaptoneurosomes (SNs) from mouse brain cortex is described. The method uses a discontinuous Percoll-sucrose density gradient allowing for the quick preparation of active SNs.

Подготовка Synaptoneurosomes от мыши Cortex использовании разрывных Перколла-Сахароза градиента плотности

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

Полированные и железобетона тоньше череп-Window для долгосрочных изображений из мозга мыши

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT has been used extensively in ophthalmology, dermatology, and gastroenterology1-3. Using a thinned-skull cortical window (TSCW), we employ spectral-domain OCT (SD-OCT) modality as a tool to image the cortex in vivo. Commonly, an opened-skull has been used for neuro-imaging as it provides more versatility, however, a TSCW approach is less invasive and is an effective mean for long term imaging in neuropathology studies. Here, we present a method of creating a TSCW in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

We present a method of creating a thinned-skull cortical window (TSCW) in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Разреженных черепа кортикальной Техника окна для<em&gt; В Vivo</em&gt; Оптической когерентной томографии изображений

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal models, including monkeys, ferrets, bats, rodents, and cats. In order to draw suitable parallels between human and animal models of auditory function, it is important to establish a bridge between human functional imaging studies and animal electrophysiological studies. Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is an established, minimally invasive method of measuring broad patterns of hemodynamic activity across different regions of the cerebral cortex. This technique is widely used to probe sensory function in the human brain, is a useful tool in linking studies of auditory processing in both humans and animals and has been successfully used to investigate auditory function in monkeys and rodents. The following protocol describes an experimental procedure for investigating auditory function in anesthetized adult cats by measuring stimulus-evoked hemodynamic changes in auditory cortex using fMRI. This method facilitates comparison of the hemodynamic responses across different models of auditory function thus leading to a better understanding of species-independent features of the mammalian auditory cortex.

Functional studies of the auditory system in mammals have traditionally been conducted using spatially-focused techniques such as electrophysiological recordings. The following protocol describes a method of visualizing large-scale patterns of evoked hemodynamic activity in the cat auditory cortex using functional magnetic resonance imaging.

Функциональной визуализации из слуховой коры у взрослых кошек с использованием высокого поля МРТ

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Онлайн Визуализация Митоз в развивающихся мышиных эмбриональных Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Двухфотонное<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Визуализация дендритных шипиков в мыши Cortex Использование разреженных черепа Подготовка

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Measuring Connectivity in the Primary Visual Pathway in Human Albinism Using Diffusion Tensor Imaging and Tractography

In albinism, the number of ipsilaterally projecting retinal ganglion cells (RGCs) is significantly reduced. The retina and optic chiasm have been proposed as candidate sites for misrouting. Since a correlation between the number of lateral geniculate nucleus (LGN) relay neurons and LGN size has been shown, and based on previously reported reductions in LGN volumes in human albinism, we suggest that fiber projections from LGN to the primary visual cortex (V1) are also reduced. Studying structural differences in the visual system of albinism can improve the understanding of the mechanism of misrouting and subsequent clinical applications. Diffusion data and tractography are useful for mapping the OR (optic radiation). This manuscript describes two algorithms for OR reconstruction in order to compare brain connectivity in albinism and controls.An MRI scanner with a 32-channel head coil was used to acquire structural scans. A T1-weighted 3D-MPRAGE sequence with 1 mm3 isotropic voxel size was used to generate high-resolution images for V1 segmentation. Multiple proton density (PD) weighted images were acquired coronally for right and left LGN localization. Diffusion tensor imaging (DTI) scans were acquired with 64 diffusion directions. Both deterministic and probabilistic tracking methods were run and compared, with LGN as the seed mask and V1 as the target mask. Though DTI provides relatively poor spatial resolution, and accurate delineation of OR may be challenging due to its low fiber density, tractography has been shown to be advantageous both in research and clinically. Tract based spatial statistics (TBSS) revealed areas of significantly reduced white matter integrity within the OR in patients with albinism compared to controls. Pairwise comparisons revealed a significant reduction in LGN to V1 connectivity in albinism compared to controls. Comparing both tracking algorithms revealed common findings, strengthening the reliability of the technique.

This manuscript describes deterministic and probabilistic algorithms for white matter (WM) reconstruction, used to examine differences in optic radiation (OR) connectivity between albinism and controls. Although probabilistic tractography follows the true course of nerve fibers more closely, deterministic tractography was run to compare the reliability and reproducibility of both techniques.

Измерение Связь в первичной зрительной Путь в человека Альбинизм Использование Diffusion Tensor визуализации и трактография

In albinism, the number of ipsilaterally projecting retinal ganglion cells (RGCs) is significantly reduced. The retina and optic chiasm have been proposed ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

Живой изображений клеток первичной коры головного мозга, с использованием системы 2D культуры

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Preparation of Peripheral Nerve Stimulation Electrodes for Chronic Implantation in Rats

Peripheral nerve cuff electrodes have long been used in the neurosciences and related fields for stimulation of, for example, vagus or sciatic nerves. Several recent studies have demonstrated the effectiveness of chronic VNS in enhancing central nervous system plasticity to improve motor rehabilitation, extinction learning, and sensory discrimination. Construction of chronically implantable devices for use in such studies is challenging due to rats&#8217; small size, and typical protocols require extensive training of personnel and time-consuming microfabrication methods. Alternatively, commercially available implantable cuff electrodes can be purchased at a significantly higher cost. In this protocol, we present a simple, low-cost method for construction of small, chronically implantable peripheral nerve cuff electrodes for use in rats. We validate the short and long-term reliability of our cuff electrodes by demonstrating that VNS in ketamine/xylazine anesthetized rats produces decreases in breathing rate consistent with activation of the Hering-Breuer reflex, both at the time of implantation and up to 10 weeks after device implantation. We further demonstrate the suitability of the cuff electrodes for use in chronic stimulation studies by pairing VNS with skilled lever press performance to induce motor cortical map plasticity.

Existing approaches for constructing chronically implantable peripheral nerve cuff electrodes for use in small rodents often require specialized equipment and/or highly trained personnel. In this protocol we demonstrate a simple, low-cost approach for fabricating chronically implantable cuff electrodes, and demonstrate their effectiveness for vagus nerve stimulation (VNS) in rats.

Подготовка электродеса стимуляции периферического нерва для хронической имплантации у крыс

Peripheral nerve cuff electrodes have long been used in the neurosciences and related fields for stimulation of, for example, vagus or sciatic nerves. ...