Этот протокол демонстрирует, как двухкоротная микроскопия In Vivo может быть использована для повторной визуализации клеточной динамики в одном и том же месте мозга в течение длительных периодов времени. Преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет изображение долгосрочных изменений в клеточных элементах мозга, в том числе расположение, морфология, и физическое взаимодействие между различными типа клеток ЦНС. Этот метод может быть особенно полезен в получении клеточно-клеточных взаимодействий, клеточной динамики и морфологических изменений во время пластичности мозга, и нейродегенерации.
Начните с подготовки несовершеннолетних или молодых взрослых, от четырех до 10 недель, CX3CR1 GFP heterozygote мыши, которая весит от 17 до 25 граммов, для имплантации черепного окна. После анестезии мыши используйте триммер для бритья волос на голове, между ушами, примерно, от уровня глаз до верхней части области шеи. Перемести мышь на стереотаксическую станцию хирургии, конус носа, и стабилизировать его голову с помощью ушных ушных шей.
Поддерживайте мышь на грелке, на протяжении всей процедуры. Смазать оба глаза масляной мази, затем ввести 100 микролитров 0,25%bupivacaine, и 100 микролитров четыре миллиграмма на миллилитр дексаметазон, подкожно на месте разреза. Подождите, по крайней мере пять минут, прежде чем продолжить.
Кровотечение бритая голова, с тремя чередующихся тампонов бетадина, и 70% алкоголя. Затем сделайте разрез средней линии головы хирургическим лезвием или ножницами. Простирается от задней части области черепа, между ушами, к лобной области между глазами.
Вырежьте оставшуюся кожу, чтобы разоблачить череп. Кровотечение соединительной ткани, расположенной между кожей головы и лежащим в основе черепа с 3%перекисью водорода, и локализовать область мозга, которая будет изображена с стереотаксическими координатами. Просверлите круговое отверстие, примерно четыре миллиметра в череп, используя зубную дрель бит.
Во время бурения регулярно смачив череп стерильным солевым раствором и ватными тампонами для охлаждения мозга. Очисти от костного мусора и смягчи кость черепа. После завершения, тщательно удалить эту часть черепа с остроконечными миппами.
После удаления черепа аккуратно поместите небольшое стекло крышки, увлажнено солевым раствором в краниотомии. Высушите лишний солевой раствор с помощью стерильной салфетки. Используя остроконечный аппликатор, нанесите клей цианоакрилата вокруг окна и дайте ему прикрепиться к мозгу и черепу.
Нанесите грунтовой клей на остальную часть черепа, и вылечить его с лечебным светом в течение 20 до 40 секунд. Создайте колодец вокруг окна с окончательным клеем, и вылечить его с лечебным светом в течение 20 до 40 секунд. Клей небольшой головной пластины на череп, на контралатеральное полушарие, краниотомия, с грунтовки клей, а затем с окончательным клеем, лечение как в течение 20 до 40 секунд.
После того, как мышь проснется, ввимите одну подкожная доза бупренорфина SR в качестве послеоперационной анальгезии, которой будет достаточно в течение 72 часов. Оживите мышь с дополнительной соленой пищей, чтобы облегчить здоровое восстановление. Визуализация может быть выполнена уже через две недели после операции по имплантации.
Используйте винты, чтобы смонтировать головную пластину на стадии двух фотон микроскопа, который должен поддерживаться при 35 градусах по Цельсию с нагревательной пластиной. Ввините мышь подкожно с 100 микролитров красителя кровеносных сосудов, таких как Родамин B.Gently очистить поверхность черепного окна с ватным тампоном, dabbed в 70% этанола. Положите несколько капель воды или солевого раствора на окно, и опустите объектив в раствор.
Убедитесь, что лазер выключен, как цель снижается, и нарисовать карту курса для обозначения основных ориентиров кровеносных сосудов, глядя через окуляр. Используйте этот рисунок для определения конкретных областей во время двух фотонной визуализации. Сбор изображений флуоресцентных клеток и сосудов с помощью двух фотонной визуализации.
Смотрите текстовую рукопись для параметров изображений, сделайте тщательные заметки с соответствующими координатами, чтобы убедиться, что точные регионы могут быть пересмотрены для последующего изображения. Нарисуйте, как несколько полей зрения в этой первоначальной сессии изображения, В конце изображения, принять мышь со сцены, дайте ему проснуться от анестезии, и вернуть его в свою домашнюю клетку. Используйте полученные заметки и изображения для повторного изображения областей во время последующих сеансов.
Этот протокол был использован для визуализации microglial Dynamics In Vivo, на Тайване YFP-H линии мышей. Специфические дендриты, служили стабильными ориентирами для тонкого картирования областей мозга. В то время как дендриты стабильны, некоторые микроглии двигаться ежедневно.
Одиночные трансгенные мыши CX3CR1/GFP, были использованы для того чтобы последовать за микроглией на up to 8 неделей. Инъекции родамина B, были использованы для обозначения сосудов, во время каждого сеанса изображения. В то время как сосуд остается стабильно фиксированной, микроглии являются динамическими.
CX3CR1/GFP мышей, были использованы для подражания микроглии до и после тяжелых припадков. Структура сосудистой кровати была сохранена, но микроглиальная клеточная сеть, и положение пейзаж был преходящим. В течение 24-48 часов после изъятий наблюдались большие изменения.
Двойные трансгенные мыши CX3CR1/GFP и NG2DS-Red использовались для отслеживания микроглии, а NG2 - для положительных клеток In Vivo. Без маркировки сосудов были выявлены микроглии, а также связанные с сосудами паразиты, а также клетки-предшественники олигодендроцитов, или ОПК. Паразиты имеют удлиненные процессы, которые следуют вдоль сосудистой стенки, и OPCs обычно показывают большие тела клеток, которые находятся в паренхиме мозга, вдали от сосудов.
При использовании родамина В ярче флуоресценция паразитов можно было отличить от более слабой флуоресценции светитального родамина, несмотря на подобное возбуждение во время визуализации. Ежедневная визуализация показала, что паразиты были стабилико расположены, в то время как OPCs и микроглии были динамичными. Важно внимательно следить за визуализировать область, нарисовать репрезентативную карту, которая была бы максимально точной, и обозначить шаги, предпринятые для достижения других мест в отношении отправной точки.
В последующих сеансах визуализации эти шаги, нарисованные вручную карты и изображения, сделанные ранее, будут иметь решающее значение для повторного определения одного и того же местоположения. Этот метод позволил исследователям прояснить нейронно-глиальные взаимодействия, нейроиммуные взаимодействия и нейроклеточную динамику длительных периодов времени как в здоровье, так и в патологии.
