Diese Methode kann wichtige Fragen im Pankreas-Isletfeld zur Differenzierung, Reifung und Regeneration der Pankreas-Islet-Linie beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Sammlung einzelner Pankreas-Isletzellen zur Generierung hochwertiger einzelliger RNA-Sequenzierungsdaten ermöglicht. Die Anwendung dieser Technik erstreckt sich auf die Therapie von Diabetes und anderen endokrine Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse durch die transkriptomische Analyse von mittelspeicheldrüsen endokrinen Einzelzellen auf die pathologischen Bedingungen.
Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da das Einsetzen der Nadel in den schmalen Gallengang der Bauchspeicheldrüse für die Perfusion schwierig sein kann. Für den embryonalen Tag 17,5 Embryonen. Nach dem Öffnen der Bauchhöhle verwenden Sie eine Ellbogenpinzette, um das Viszeralgewebe in eine sechs Zentimeter schwarze Bodenschale mit kaltem PBS zu übertragen.
Verwenden Sie Zangen, um die Bauchspeicheldrüse vom Viszeralgewebe zu lösen. Und legen Sie das Bauchspeicheldrüsengewebe in eine 20 Milliliter Durchstechflasche mit fünf Milliliter kalte Kollagennase-Lösung. Für postnatale Tag null bis 15 Mäuse, sezieren Sie sorgfältig alle Lappen der Bauchspeicheldrüse, bevor Sie das Gewebe in die Kollagenase legen.
Für postnatalen Tag 18 bis 60 Mäuse, entfernen Sie zuerst die Xiphoid und extrahieren Sie den Darm auf der rechten Seite der Bauchhöhle. Drücken Sie die linken und rechten medialen Lappen der Leber auf jede Seite, um die Gallenblase und den gemeinsamen Gallengang freizulegen. Und klemmen Sie das Zwölffingerdarm mit einem Paar kleiner Gefäßklemmen an der oberen und unteren Position, um die Stelle zu flankieren, an der der Gallengang in das Zwölffingerdarm eindringt.
Als nächstes laden Sie eine 5-Milliliter-Spritze mit einer 30-Spur-Nadel mit Kaltkollagenase-Lösung. Und verwenden Sie das Mikroskop, um die Nadelspitze in die Gallenblase einzufügen. Sorgfältig und reibungslos manipulieren Sie die Nadel durch den gemeinsamen Gallengang.
Und drücken Sie den Kolben, um die Bauchspeicheldrüse mit ein bis fünf Milliliter der Kollagenase-Lösung entsprechend der Größe der Maus zu durchdringen. Wenn die gesamte Lösung durchsetzt ist, verwenden Sie Zangen, um die Bauchspeicheldrüse sofort in eine 20-Milliliter-Durchstechflasche mit fünf Milliliter frischer Kaltkollagenaselösung zu übertragen. Wenn das gesamte Bauchspeicheldrüsengewebe gesammelt wurde, legen Sie die Durchstechflasche für drei Minuten in ein 37 Grad Celsius Wasserbad, gefolgt von drei bis fünf Minuten sanftem Schütteln.
Dann filtern Sie das verdaute Produkt durch ein 0,25-Millimeter-Nylonsieb in ein neues 50-Milliliter-Zentrifugenrohr. Und verwenden Sie eine 20-Milliliter-Spritze mit eiskaltem PBS, um das Sieb gründlich zu waschen. Zentrifugieren Sie für den postnatalen Tag 18 bis 60 Pankreata die gefilterte Probe und setzen Sie das Gewebe in 30 Millilitern kalten PBS wieder auf.
Dekantieren Sie dann die Gewebesuspension in eine sechs Zentimeter schwarze Bodenschale und verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipette und ein Sezierendes Mikroskop, um die Inselchen für den Transfer in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr mit einem kleinen Volumen kalter PBS zu pflücken. Für den embryonalen Tag 17,5 nach dem Geburt Tag 15 Pankreata zentrifugieren Sie das gefilterte Bauchspeicheldrüsengewebe und setzen Sie das Pellet in Trypsin-EDTA-Lösung für eine vierminütige Inkubation in einem 37 Grad Celsius Wasserbad aus. Versuchen Sie am Ende der Inkubation, das Pellet eine Minute lang mit einer 200-Mikroliter-Pipette zu bewerten, gefolgt von der Zugabe des 0,5-fachen Volumens des kalten fetalen Rinderserums mit einem sanften Wirbel, um die Verdauung zu stoppen.
Dann sammeln Sie den Digest durch Zentrifugation und setzen Sie die Zellen in 200 Mikroliter FACS Puffer in einem 5 Milliliter FACS Rohr für die Sortierung durch Durchflusszytometrie. Für Einzelzellkommissionierung und Lyse, aliquot frisch zubereitete Zelllyse Puffer in acht Streifen PCR-Röhren, und übertragen eine einzelne Zelle in jede. Wirbeln Sie die Proben, um die Zellen für die Freisetzung der RNA zu lysieren, gefolgt von Zentrifugation für 30 Sekunden bei vier Grad Celsius und sofortige Lagerung auf Eis.
Für die umgekehrte Transkription, inkubieren Sie die Lysate für drei Minuten bei 72 Grad Celsius gefolgt von einer Minute auf Eis. Zentrifugieren Sie die Proben kurzzeitig für 30 Sekunden bei vier Grad Celsius und fügen Sie 5,7 Mikroliter Reverse-Transkriptions-Mix zu jeder Probe hinzu, um das Gesamtvolumen auf 10 Mikroliter für jede Probe zu bringen. Nach sanfter Wirbelung und Zentrifugation die Proben in einen Thermocycler laden und das Reverse-Transkriptionsprogramm starten.
Für die Polymerase-Kettenreaktions-Vorverstärkung oder PCR 15 Mikroliter PCR-Mix zu jeder Probe hinzufügen, die die ersten Strangreaktionen enthält, gefolgt von sanfter Wirbelung und Zentrifugation. Dann laden Sie die Proben in den Thermocycler und starten Sie das PCR-Programm. Für die PCR-Reinigung 25 Mikroliter resuspendierte DNA-Reinigungsperlen zu jeder Probe hinzufügen und durch Wirbelgut vermischen.
Dann drehen Sie die Proben schnell bei Raumtemperatur, um die Flüssigkeit zu sammeln, während die Besiedlung der Perlen zu vermeiden. Legen Sie die Proben nach fünf Minuten bei Raumtemperatur auf einen geeigneten Magnetischen Ständer, indem Sie den Überstand vorsichtig entfernen und entsorgen, wenn die Lösung klar ist. Waschen Sie die Perlen mit zwei 30-Sekunden-Wäsche in 200 Mikroliter frisch zubereitetem 80% Ethanol pro Wäsche.
Und das restliche Ethanol nach der zweiten Wäsche entsorgen. Wenn die Perlen Luft getrocknet haben, fügen Sie 11 Mikroliter Nuklease-freies Wasser hinzu, um das DNA-Ziel von den Perlen zu befreien, gefolgt von Wirbeln. Dann zentrifugieren Sie die Proben schnell, geben Sie die Proben an den magnetischen Standfuß zurück, bis die Lösung klar ist, und übertragen Sie 10 Mikroliter jeder Probe in ein neues PCR-Rohr.
Erfolgreich verstärkte cDNA sollte eine volle Länge über 500 Basenpaare haben und von 1,5 auf zwei Kilo Basenpaare angereichert werden. Darüber hinaus gibt es in der Regel eine 500 bis 600 Basenpaar-Anreicherung von cDNA in Insulin ein RFP plus Zellen beobachtet, die die Insulin-Transkripte darstellen können. Die cDNA-Fragmente in der Nähe von 100 Basenpaaren sind jedoch Primer-Dimere, die in der Regel durch übermäßige Primer verursacht werden und die durch Wiederholung des DNA-Reinigungsschritts entfernt werden müssen.
Die cDNA-Fragmente zwischen 100 und 500 Basenpaaren stellen in der Regel eine degradierte cDNA dar, die durch schlechte Zellstatus- oder Regionsprobleme wie RNase-Kontamination verursacht wird und ausgeschlossen werden sollte. Nach der Reinigung der cDNA-Bibliotheken zur Sequenzierung kann cDNA im Bereich von 250 bis 450 Basenpaaren durch Zugabe von DNA-Reinigungsperlen zur ersten und zweiten Reinigungsrunde erhalten werden. Nach der DNA-Perlenreinigung sollte die Sequenzierungsqualitätsbewertung während der Sequenzierungsqualitätsbewertung größer als 30 sein.
Um qualitativ hochwertige Zellen für nachgelagerte Analysen zu erhalten, werden Zellen mit weniger als 0,5 Millionen kartierten Lesevorgängen oder mit weniger als 4.000 nachgewiesenen Genen ausgeschlossen, was die Charakterisierung verschiedener Zellgruppen und die Identifizierung von Genen erleichtert, die nach der Hauptkomponentenanalyse und hierarchischen Clusterbildung heterogen in verschiedenen Gruppen exprimiert werden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Bauchspeicheldrüse schnell vor der Kollagenase-Verdauung zu durchdringen, um eine Letin über die Verdauung zu vermeiden und die rNase freie Umgebung während der Einzelzellverfahren zu erhalten. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Islet Imaging und Kultur durchgeführt werden, um die Visualisierung der Isletstruktur zu erleichtern und zelluläre Reaktionen und Arzneimittelstimulation zu untersuchen.
Nach der Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Bauchspeicheldrüsenforschung, um die Mechanismen der Entwicklung und Regeneration von Isletlinien sowie der Diabetesprogression bei Säugetieren zu erforschen.
