Протокол позволяет быстро изолировать функцию небольших субпопуляций клеток в островках поджелудочной железы Лангерханов. Преимущества этого метода включают характер в реальном времени и высокую статистическую мощь и, следовательно, высокую воспроизводимость полученных данных. Чтобы обездвижить островки для визуализации, соберите камеру визуализации для перевернутого микроскопа и поместите стеклянную крышку скольжения внутри камеры.
Убедитесь, что интерфейс стеклянной камеры водонепроницаем и подтвердите, что крышка скольжения находится в пределах досягаемости микроскопа цели. Далее, вырезать 20 на 20 миллиметров квадратов тонкой и грубой сетки и использовать от 45 до 50 микрометров куски толстой липкой лентой, чтобы создать две стенки спейсера на кусок тонкой сетки. Погрузите грубую сетку и вес в 35-миллиметровую чашку Петри из раствора для визуализации и поместите тонкую сетку под рассечение микроскопа.
Поверните тонкую сетку со стенами спейсера вверх дном и проемеры, обращенные вверх. И использовать р20 пипетки для передачи нескольких островков между двумя spacers. Используя часовщики'forceps, поместите сетку вверх дном внутри камеры визуализации перевернутого микроскопа так, чтобы промецаторы лицом вниз, чтобы сидеть прямо на крышке камеры скольжения, захвата островков между spacers и сетки в середине крышки скольжения.
Позаботьтесь о том, чтобы сетка хорошо увлажнялась, не содержащий избыточных объемов раствора, который спровоцировал бы боковое движение образца. Затем поместите грубую сетку и вес поверх тонкой сетки в камеру и добавьте в камеру решение для визуализации. После того, как островки были обездвижены, выберите режим изображения и цель на перевернутый микроскоп и поместите камеру с островками на температурно-контролируемой стадии микроскопа.
Установив перфузию, распоистите приток ниже оттока в камере и установите поток оттока, чтобы быть больше, чем поток притока. Убедитесь, что отток имеет минимальный контакт с раствором, так что он удаляет раствор в нескольких последовательных малых капель, избегая длительных интервалов непрерывного удаления раствора. Далее, инициировать перфузии с изображением раствор, содержащий три миллимоляонных глюкозы, и выбрать путь света и фильтры для изображения зеленых флюорофоров.
Затем запустите живую визуализацию, чтобы настроить параметры изображения и настроить представление, чтобы захватить представляющие интерес островки. Для оптимизации соотношения сигнала к шуму изображения, отрегулируйте интенсивность возбуждения света, время экспозиции и биннинг, гарантируя, что настройки позволяют четко визуализировать каждую ячейку в островках при минимально возможной интенсивности света и экспозиции. Затем изображение островков на 0,1 до 5 герц, проверка качества приобретенных данных, как он захвачен.
Когда активность альфа-клеток обнаруживается, используйте онлайн диаграмму динамики сигнала в программном обеспечении приобретения, насколько это возможно, и добавить адреналин или глутамат в раствор ванны в течение двух-пяти минут. Быстрый скачок кальция с последующим замедлением или отменой колебаний альфа-клеток будет наблюдаться. Затем добавьте грелин, который, как недавно сообщалось, активирует дельта-клетки выборочно.
Быстрое обратимое увеличение кальция будет наблюдаться в небольшой субпопуляции островковых клеток. Затем добавьте 10 миллимолярдных глюкоз. Будет наблюдаться скоординированная колеблющаяся реакция в субпопуляции бета-клеток.
Обратите внимание также на реакции клеток, которые ранее были активированы адреналином или глутамата и грелина. После сохранения изображений импортируют данные в соответствующую программу анализа данных и нормализуют необработанные данные об интенсивности флуоресценции до первоначального значения флуоресценции. Если набор данных о изменчивости клеток к клетке по-прежнему является существенным, определите область управления для диапазона времени, в течение которого было применено контрольное решение.
Если область управления имеет четкий неявляющийся сигнал, предположим, что интенсивность флуоресценции возвращается к исходной точке после каждого применения контрольного решения. Чтобы исправить данные промежуток времени для каждой ячейки, разделите данные на сегменты, разделенные точками, в которых было добавлено решение управления, и примените линейную коррекцию к каждому сегменту. Если диапазон управления имеет четкие колебания или присутствуют дополнительные факторы, используйте алгоритм обнаружения шипов.
Для измерения частоты всплесков кальция и реакции на добавление агонистов и антагонистов, разделить запись на равные интервалы времени, подсчитать шипы в интервале, и нормализовать к интервалу продолжительность вычислить время курса частичной частоты. Кроме того, установите порог и вычислите фракцию плато для каждого из интервалов. Фракция указывает процент времени в интервале, который клетка провела в возбужденном состоянии.
Или вычислить частичную область под кривой для каждого из интервалов. Если липидный состав мембраны не пострадал, островки достаточно хорошо загружаются тропическими красителями. Вектор аденовируса человека типа 5 также успешно нацелен на островковых клеток.
Кальций пики в альфа-клеток могут быть легко обнаружены при низких уровнях глюкозы, и есть высокая корреляция клеток за клетками между активностью при низком уровне глюкозы и ответ на адреналин и глутамат. Грелин активирует некоторые адреналиновые реакционые клетки с низким содержанием глюкозы, но не влияет на динамику кальция в большинстве клеток, которые активируются низким содержанием глюкозы. При анализе с точки зрения частичной частоты, адреналина или грелина стимулируемые клетки отображают значительное увеличение в условиях "все или ничего", хотя общие изменения между базальным пики и адреналин эффект тонкий.
В отличие от этого, частичная область под кривой чувствительна к изменениям, введенным адреналином во всех клетках, даже когда базальная активность высока. Убедитесь, что все сетки находятся в контакте с решением изображений и заботиться, чтобы распоставить ткани достаточно плотно, чтобы избежать пузырьков воздуха. Метод может быть расширен, чтобы включить искусственный интеллект для дифференциации между типами клеток.
Фармакологические маркеры могут быть заменены технологией распознавания образов, тем самым сокращая время записи.
