Кардиомиоциты, генерируемые из индуцированных плюрипотентных стволовых или IPS-клеток, все чаще используются для ответа на различные биологические вопросы в области сердечной электрофизиологии. Основными преимуществами этой технологии является то, что она позволяет резкое увеличение пропускной способности, а также подтип конкретных потенциальных действий записей в желудочков, как миоциты, используя желудочковый конкретный элемент промоутера. Внедрение генетически закодированных датчиков напряжения с помощью лентивирусной трансдукции позволяет оптический визуализации человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных кардиомиоцитов потенциалы действия.
Начните с смешивания лентивирусно-содержащей клеточной культуры супернатанта с кардиомиоцитов поддержания среды, на один к одному соотношению. Добавьте бромид гексадиметерин при конечной концентрации 8 микрограмм на миллилитр, чтобы повысить эффективность инфекции. И заменить кардиомиоцитов поддержания среды в IPS клеток полученных кардиомиоцитов культуры блюдо, с инфекцией среды.
Культура инфицированных кардиомиоцитов в течение 12 часов при 37 градусах по Цельсию, и заменить инфекции среды со свежими кардиомиоцитов поддержания среды. Перед визуализацией обменяйте среду клеточной культуры раствором Тирода, дополненным кальцием. Затем поместите кардиомиоциты в камеру визуализации на стадии перевернутого микроскопа эпифлюоресценции, оснащенного сплиттером изображения.
Если требуется электрический темп, установите электроды в камеру визуализации и подключите электроды к генератору стимулов. Сосредоточьте клетки и найдите ячейку, выражают генетически закодированный индикатор напряжения в центре поля обзора. Установите оптический путь так, чтобы излучаемый свет был переключен на сплиттер изображения и переключил куб фильтра в микроскоп на тот, который будет сочетаться с фильтрами в сплиттере изображения.
В программном обеспечении, контролируя камеру, установите настройку приобретения так, чтобы высокоскоростная визуализация была возможна, и наведи сплиттер изображения в соответствии с инструкциями производителя. Два изображения, представляющие две различные полосы длины волны излучения, должны быть рядом друг с другом, каждый из которых занимает половину изображения. Проверьте и отрегулируйте фокус изображения, производимого камерой по мере необходимости.
И отрегулируйте яркость освещения таким образом, чтобы избежать насыщения пикселей. Установите приобретение часовой серии, и тусклый свет в комнате, чтобы избежать рассеянный свет, влияющий на измерение. Затем откройте возбуждающий свет затвора и начать приобретение серии изображений, начиная электрический темп в соответствующую точку времени, как экспериментально уместно.
Когда приобретение закончено, закройте затвор возбуждения света по мере необходимости и сохраните запись на жестком диске. Затем, оставив запись без изменений, зафиксв фон над областью обложки без ячеек. Для анализа оптических мембран потенциальных записей, открыть tiff стек, содержащий клетки в ImageJ, и использовать инструмент свободного выбора руки, чтобы привлечь область интереса над флуоресцентным кардиомиоцитом, в красном канале, заботясь, что область достаточно велика, что клетка не будет двигаться из региона при заражении.
Далее выберите анализ, инструменты, менеджер по интересам и выберите Add T, чтобы добавить регион как регион интересов 1. Перетащите область интереса над той же ячейкой в зеленом канале, и добавить этот регион, как регион интересов 2. В меню «Анализ и набор измерений» не выбраны все варианты, за исключением среднего серого значения.
В регионе менеджера интересов щелкните Больше и Multi Measure, чтобы выбрать меру всех срезов и одну строку на срез вариантов и нажмите OK. Откроется окно, содержащее электронную таблицу с тремя строками. Используйте файл и сохранить Как сохранить электронную таблицу в запятую разделенного файла значения. Закройте окно стеком изображения и окном электронной таблицы, не закрыв окно менеджера по региону интересов, и откройте стек tiff, содержащий фоновое измерение.
В регионе менеджера интересов щелкните больше и multi измерение для того чтобы выбрать измерение все ломтики и одну строку в варианты ломтика и щелкните ОДОБРЕНО. Затем сохраните фоновые данные в отдельном файле csv. Здесь показан представительный кардиомиоцит IPS-клеток с белыми пунктирными линиями, обозначающий области интереса, нарисованные в ходе анализа изображений в каналах RFP и GFP. Сигнал от канала RFP демонстрирует периодическое увеличение флуоресцентной интенсивности во время каждого действия потенциала из-за увеличения принудительной или резонансной передачи энергии, вызванной изменениями в мембранном потенциале.
Соответственно, сигнал GFP демонстрирует периодическое снижение флуоресцентной интенсивности. Соотношение RFP/GFP является биологическим сигналом, используемым в анализах ниже по течению, таких как потенциальная продолжительность действия 50 и 90 измерений. Например, с помощью этого метода, 30-дневный желудочков, как IPS клеток полученных кардиомиоцитов, размещенных на 0,5 Герц, показали среднее действие потенциальной продолжительности 50 из 439 миллисекунд, и среднее действие потенциальной продолжительности 90 из 520 миллисекунд.
Электрическая стимуляция кардиомиоцитов, полученных из клеток IPS, при увеличении скорости стимуляции каждые пять ударов, продемонстрировала постепенное сокращение потенциалов действия по мере увеличения скорости избиения. Кроме того, лечение спонтанно избиения IPS клеток полученных кардиомиоцитов с изопротернол, неселективный агонист рецепторов бета-адрено, привело к быстрому увеличению скорости избиения, которые могут быть дополнительно увеличены с увеличением доз агониста. Хотя этот метод обеспечивает превосходную пропускную способность по сравнению с классическими электрофизиологическими измерениями, необходимо знать о его ограничениях, включая временное разрешение, которое ограничено внутренними кинетическими свойствами датчика флуоресцентного напряжения.
