Сердечная недостаточность является основной причиной смерти как мужчин, так и женщин в мире. Новые данные свидетельствуют об изменении сердечного и системного обмена веществ, способствующих патологии сердечной недостаточности. Быстро определить, какие метаболиты влияют на возбуждение-сокращение связи по-прежнему является проблемой.
Традиционный подход к изоляции сердечного миоцита от взрослой мыши является трудоемким и сложным процессом. Инновационный метод в этой статье делает строгий процесс более эффективным и легким в работе. Кроме того, используя флуоресцентный зонд, мы можем выполнить много фенотипических оценок того, как химические вещества могут вызвать сердечную токсичность или дисфункцию на клеточном уровне.
Путем определять которые молекулы изменяют функцию myocyte, новые терапевтические методы можно определить для обработки сердечной недостаточности. Используя трансгенных мышей, мы можем исследовать различные гены, чтобы определить, какие могут предотвратить и способствовать сердечной недостаточности. Эта информация будет иметь важное значение в будущем лечение сердечной недостаточности.
Демонстрацией процедуры будут Мэтью Клос и студент Шрейас Суреш. Для начала оттаивать рабочий раствор ламинина на льду. Используя P1000 пипетку, аспирировать 200 микролитров ламинина и осторожно перетащите наконечник пипетки вдоль одного края стерилизованного крышки, чтобы капиллярное действие, чтобы вытащить мизерное количество ламинина для облегчения присоединения крышки к шести-хорошо пластины.
Затем изгнать оставшийся ламинин в центре крышки круговыми движениями. Распространение капли ламинина через крышку. Поместите крышки в инкубатор 37 градусов по Цельсию, по крайней мере один час и до 24 часов до изоляции.
Чтобы изолировать миоциты от подготовленного сердца в холодном KHB-HB, поместите образец под стерео микроскопом. Чтобы предотвратить эмболи, премьер аорты канюли, погружая его в раствор KHB-HB и с помощью 20 миллилитров шприца, чтобы заставить раствор до конца. Убедитесь, что сердце погружено в воду и канюля загрунтовына перед иссечением сердца.
С 5 типсов, cannulate сердце. Подтвердите правильное позиционирование канюли, визуализируя кончик канюли примерно на миллиметр выше аорты в желудочек. Затем начните поток KHB-HB, вращая стопкок на Лангендорфе.
Соедините канюлю с Лангендорфом, чтобы пронизать сердце в течение пяти минут. Затем поверните стопкок, чтобы переключить перфузию из резервуара KHB-HB в буферный резервуар пищеварения. Как только буфер пищеварения достигнет сердца, установите таймер.
Соберите перфусат в стерильном стакане 100 миллилитров. Пополнить буферный резервуар пищеварения по мере необходимости с перфусатом до тех пор, пока время пищеварения истекло. После пищеварения, в стерильной 100 миллилитровой стакан, отделить камеры сердца с типсами и ножницами Iris.
Поместите каждую камеру в отдельный колодец из шести хорошо пластины. Налейте пять миллилитров раствора коллагеназы в каждый колодец. Немедленно используйте ножницы для того чтобы mince ткань сердца в ломки приблизительно одного кубического метра.
Используя стерильную трубу передач, аккуратно тритурировать рубленую сердечную ткань с буфером пищеварения. Как только куски ткани становятся белыми и пернатыми, поместите пластину под перевернутый микроскоп для изучения клеток. Если количество жизнеспособных клеток превышает 80%, продолжайте напрягать клетки в 50 миллилитровую коническую трубку с помощью 100 микрон-клеточного ситечко.
Если количество жизнеспособных ячеек меньше 80%, проверьте время, необходимое для канюля. Если время канкуляции составляет более пяти минут, попробуйте другое сердце. Если нет, пройдите анализ новых слотов коллагеназы через программу отбора проб коллагеназы.
Далее, гранулы клеток центрифугирование на 215 раз г в течение двух минут. Гранулы должны быть компактными и не рыхлыми. Если гранулы свободны, препарат содержит много мертвых клеток.
В капюшоне культуры ткани, resuspend компактные гранулы в 10 миллилитров остановки буфера. Пеллет клетки снова центрифугирования в 215 раз г в течение двух минут. Переусепенка ячеек в пяти миллилитров буфера покрытия.
Выполните счетчик клеток на счетчике цитоцитов и отрегулируйте объем буфера покрытия, чтобы достичь конечной концентрации миоцитов в два раза 10 до четырех клеток на миллилитр. Теперь удалите крышки с покрытием ламинина из инкубатора. Аспирировать капли ламинина, если присутствует.
Плита 200 микролитров подвески миоцитов на каждой крышке. Поместите крышки в 37 градусов по Цельсию инкубатор с 21%кислорода и 5%углекислого газа в течение двух часов, чтобы вложение. Через два часа вынул крышки и аспирировать непривязанные клетки.
Добавьте два миллилитров культурных медиа и культуры в инкубатор при 37 градусах по Цельсию на срок до четырех дней. Во-первых, удалите компонент А и компонент В из мембранного потенциального комплекта. В 15 миллилитровой конической трубке объединить 50 микролитров компонента В и пять микролитров компонента А для формирования смеси красителя напряжения.
Вихрь смешивать. Добавьте 10 миллилитров облицовочные средства массовой информации в 15 миллилитровую коническую трубку, содержащую смесь красителя напряжения, чтобы сформировать мембранную потенциальную смесь красителя. Опять же, вихрь смешивать.
Затем удалите одну пластину из шести хорошо миоцитов из инкубатора. Аспирировать средства массовой информации. Добавьте 800 микролитров мембранной потенциальной смеси красителя к каждой колодец.
Накройте тарелку фольгой и оставьте тарелку при комнатной температуре на 15 минут. После этого, аспирировать смесь красителя средств массовой информации из каждой хорошо и добавить один миллилитр раствора модифицированного Tyrode к каждой хорошо. Накрыть фольгой.
Включите оборудование в порядке микроскопа, дуговой лампы, HyperSwitch, системы флуоресценции интерфейса, питания MyoCam, полевого стимулятора и компьютера. Убедитесь, что наборы фильтра выбросов возбуждения подходят для красителя изображений. Например, фура-2 возбуждается на 340 нанометров и 380 нанометров света.
Он излучает на 510 нанометров света. Флуо-4 и краситель мембраны напряжения возбуждаются на 485 нанометров света и излучают на 520 нанометров света. Премьер системы записи, включив вакуум, полностью открывая шланг зажим, и осторожно погружая каждый 60 миллилитров шприц с раствором Тирода в многообразии.
Для записи кальция используйте стандартный раствор Tyrode. Для записи напряжения используйте модифицированный раствор Tyrode. Включите в линию обогревателя.
Поддерживайте температуру, чтобы перфусировать в камере на 36 плюс или минус один градус по Цельсию, по крайней мере 15 минут. Далее откройте программное обеспечение для приобретения. Убедитесь, что параметры установлены для правильного красителя изображения.
Выключите стимулятор. В темноте снимите фольгу с шести-хорошо пластины и поместите крышку в ходить камеры. Поместите пластину под микроскопом и сосредоточьтесь на миоцитах, используя цель 10X.
Оказавшись в фокусе, начните ходить по полю, стимулируя на одном герце и 0,2 вольт. Постепенно увеличиваем напряжение до тех пор, пока не будет получен один-к-одному темпу. Затем увеличьте напряжение до 1,5 раза, когда порог будет достигнут.
Переключитесь с цели 10X на цель 40X. Сосредоточьтесь на ячейке, которая следует один-к-одному темпу. Отрегулируйте пластиковые оттенки, чтобы только одна ячейка была в поле зрения.
Используя программное обеспечение, поместите область процентной коробки на четко определенные саркомеры. Запустите программное обеспечение для приобретения, чтобы инициировать возбуждение света. Используя фильтры нейтральной плотности, соответствующим образом отрегулируйте настройки интенсивности, чтобы получить адекватное соотношение сигнала к шуму.
Здесь показаны репрезентативные следы кальция и саркомерного сокращения, записанные из миоцитов мыши C57BL/6 с помощью фуры-2. Количественная оценка ансамбля усредненные данные, полученные от C57BL/6 мышей и их трансгенных товарищей помета не показывает никакой разницы между группами, за исключением времени релаксации на 10 герц ходить. Отслеживание напряжения, записанное с помощью мыши C57BL/6 с темпом 10 герц, было обработано для получения годного к использования сигнала.
Ансамбль усреднил потенциал действий после низкого прохода Баттерворта или цифрового фильтра Savitzky-Golay, который показывает тонкие различия в форме потенциалов действий. Следы, записанные из крысиных миоцитов темп на одном герц показывает, в дополнение к сигналу напряжения ниже, чем сигнал кальция, сокращение кинетики различны, а также. Это потому, что красители кальция буфер кальция в то время как напряжение красителей нет.
Как и в случае с переходным кальцием, миоциты продемонстрировали зависимые изменения в их оптической потенциальной продолжительности действия. Было также продемонстрировано вызванное наркотиками продление действия потенциала. Последние 11 секунд 20-секундной записи показали, что длительное воздействие миоцитов на синий свет приводит к срабатываемой активности.
При попытке этой процедуры, самое главное помнить, чтобы использовать свет низкой интенсивности возможно, чтобы вы не повредить миоциты. Миоциты, изолированные с помощью нашего подхода, также могут быть использованы для иммуногистохимии или проведены для анализа западных помарк. Красота этого метода, это позволяет исследователям быстро оценить, как разнообразие молекул и генов помогают возбуждение-сокращение связи с помощью одной системы.
