Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы основной иммунобиологии и воспалительных заболеваний кишечника исследований в отношении адгезии каскад иммунных клеток, необходимых для самонаведения к периферических органов. Основным преимуществом этой техники является то, что это удобный и простой подход для ответа на функциональные вопросы в контексте клеточной адгезии в условиях потока. Хотя этот метод был разработан для изучения механизма клеточных poietic анти-интегрин антител при воспалительных заболеваниях кишечника, он может быть изменен для анализа аналогичных проблем в других воспалительных заболеваний.
Начните с растяжения кусок резиновой трубки на одной стороне с маленькими ножницами, чтобы вставить прямоугольный капилляр примерно 0,5 сантиметров в трубку. Затем запечатай связь с парафиновой пленкой. Пальто капилляр с 20 микролитров addressin интереса и печать стороны не подключены к трубе с пластиковой парафиновой пленкой, по крайней мере один час инкубации при 37 градусов по Цельсию.
В конце инкубации снимите пластиковую парафиновую пленку и дайте жидкости вымочить капилляр на бумажное полотенце, чтобы опорожнить трубы. Затем блокируйте капилляры с 20 микролитров блокирующего раствора, по крайней мере один час при 37 градусах по Цельсию. Очень важно применять блокировку к капилляру сразу после удаления покрытия, чтобы избежать высыхания капилляров, так как это может ухудшить функциональность закодированных белков.
В то время как капилляр блокируется, добавить 18 миллилитров антикоагулярной всей человеческой крови из 50 миллилитров трубки и разбавить кровь до общего объема 35 миллилитров с PBS. Слой 10 миллилитров градиентной среды плотности под раствором крови и изолировать периферические моноядерные кровяные клетки крови по плотности градиентной центрифугации. В конце отделения перенесите периферические моноядерные клетки крови из интерфейса градиентной среды плотности в новую 50-миллилитровую трубку.
И довести общий объем в трубке до 50 миллилитров со свежим PBS. После центрифугации, повторно гранулы в 10 миллилитров свежего PBS для подсчета и пятно клеток с подходящим красителем отслеживания клеток в соответствии с инструкциями производителя. В конце инкубации окрашивания, собирать клетки центрифугации и повторно гранулы в 1,5 раза 10 до шести клеток на миллилитр полной RPMI средней концентрации.
Затем семя один миллилитр клеток в столько колодцев 48 хорошо пластины, как Есть условия. И добавить соответствующий объем анти-интегрин антитела к соответствующим скважинам в течение одного часа инкубации при 37 градусах по Цельсию. Далее используйте P1000 пипетки для повторного перерасхода клеток несколько раз, прежде чем передавать клетки в отдельные две миллилитровые трубки.
Промыть каждый хорошо с одним миллилитров PBS и бассейн моет в соответствующих двух миллилитров труб. После подсчета, гранулы клеток центрифугации и повторно клетки в соответствующем объеме адгезии буфера, чтобы получить 1,5 раза десять-шестой клетки на миллилитр суспензии. Затем добавьте соответствующий объем хлорида марганца в каждую трубку в одну миллимолярдную окончательную концентрацию.
Когда клетки будут готовы, включите микроскоп и выберите соответствующие фильтры и лазеры, объективный и режим приобретения. Удалите пластиковую парафиновую пленку с кончика капилляра и используйте ножницы, чтобы растянуть пятисимметровый кусок резиновой трубки, чтобы капилляр был подключен к меньшей трубке. Печать связи между капилляром и трубкой с пластиковой парафиновой пленкой.
И смонтировать капилляр на подносе фиксации. Поместите лоток на поднос держатель микроскопа, чтобы капилляр находится в центре внимания. И вставьте резиновые трубки в соответствующую выемку перистального насоса.
Поместите непривязанный конец трубки в первую пробную трубку, содержащую подвесную клетку. И вставьте короткую трубку на другой стороне капилляра в 15 миллилитровую трубку, чтобы собрать поток через. Пусть трубки заполнить на 500 микролитров в минуту скорость потока, пока подвеска клетки почти достигает капилляров.
Затем дайте капилляру заполнить со скоростью потока 100 микролитров в минуту. Когда капилляр заполнен клетками, отрегулируйте скорость потока до 10 микролитров в минуту и захватить покадровой промежуток изображения клеток, медленно движущихся через капилляр вдоль внутренней части стенки с покрытием адресина каждые две секунды в общей сложности три минуты. После того, как подвеска клетки достигает внутренней части капилляра, очень важно, чтобы избежать прерывания потока, как это приведет к статической интегрин addressin взаимодействия потенциально смещения измерения.
Перед отбрасывания потока весь капилляр через окуляр микроскопа, чтобы убедиться, что раздел наблюдается на экране является репрезентативным. Освободите трубку от насоса и дайте оставшейся жидкости бежать обратно в двухмилитровую трубку. Затем отключите капилляр и трубки от лотка фиксации и изображение следующего капилляра, как только что продемонстрировано.
Чтобы оценить записи промежуток времени, откройте первую последовательность в соответствующем программном обеспечении анализа и экспортировать первые и последние три изображения в качестве файлов TIFF. Откройте три начинающих изображения в ImageJ и выберите изображение, тип и 32-битный для преобразования изображений в 32-битные. Затем выберите каналы изображения, цвета и слияния, чтобы объединить изображения в одно изображение и преобразовать композитное изображение в RGB для сохранения в качестве файла TIFF.
После преобразования последних трех изображений таким же образом, подсчитайте белые клетки, видимые в начале, и закончив композитные изображения. И вычесть количество белых клеток в начале изображения из числа белых клеток в конечном изображении. Перфузия капилляров, покрытых ICAM-1, VCAM-1, MAdCAM-1, но не Isotype Fc химера с человеческими ПКМК приводит к заметной адгезии, когда один из трех адресов присутствует.
В отличие от этого, ингибирование интегрин addressin взаимодействий с использованием нейтрализации антител, как правило, приводит к заметному снижению динамической адгезии, которая отсутствует при добавлении антитела контроля изотипа. Кроме того, лечение CD4 человеческих Т-клеток с конкретными хемокинами приводит к увеличению адгезии адресинов по сравнению с необработанными клетками человека. При попытке этой процедуры, очень важно помнить, что различные факторы способствуют динамической адгезии клеток in vivo, которые не могут быть полностью резюмированы в этом анализе.
Тем не менее, можно скорректировать анализ для решения очень сложных вопросов. Для того, чтобы решить дополнительные вопросы о дифференциальной адгезии поведение тестирования типов клеток, можно также выполнить конкурентные анализы адгезии с различными типами клеток помечены с различными красителями отслеживания клеток. После его развития, этот метод позволил нам изучить последствия различных анти-интегрин антител, используемых или в настоящее время в разработке для лечения воспалительных заболеваний кишечника.
