Используя интравитарновую микроскопию, этот протокол позволяет в режиме реального времени визуализировать кишечную ткань до разрешения одной клетки и изучать высокодинамительные процессы, такие как пролитие клеток. В сочетании со стандартными экспериментами трассировщика, этот протокол позволяет идентифицировать как кишечные нарушения проницаемости в vivo и различие между пара и трансцеллюлярной проницаемости. Этот протокол можно было бы использовать в качестве основы для разработки дополнительных подходов к интравитальной микроскопии для визуализации других высокодинамизирующих клеточных процессов интересов в различных тканях.
Визуальная демонстрация этого метода имеет важное значение для понимания хирургических шагов подготовки и позиционирования живого животного таким образом, что облегчает получение изображения на поверхности слизистой оболочки кишечника. Перед началом процедуры включите основание и сканер коробки конфокального лазерного сканирующего микроскопа и нажмите, начните включить компьютер. Запустите программное обеспечение для получения изображений и выберите соответствующую конфигурацию.
Чтобы установить соответствующее разрешение изображения, выберите конфигурацию, аппаратное обеспечение, разрешение, глубину бита и 12. В меню приобретения выберите XY'T для режима приобретения изображения и установите цель до 20 или 40X. Чтобы настроить последовательных параметров приобретения, нажмите искать и добавлять и выбирать между кадрами.
Чтобы настроить последовательность один, включите видимую лазерную коробку. Установите фотомультипельную трубку, чтобы она была на ней, и определила длину волны выбросов. Чтобы настроить последовательность два, включите видимую лазерную коробку.
Установите фотомультипельную трубку два, чтобы на и определить длину волны выброса. Затем активируйте соответствующие лазеры. После подтверждения отсутствия ответа на щепотку ноша, используйте ватный тампон, чтобы применить мазь к глазам обезболивающей мыши и сделать один сантиметр разреза в области левого желудочка живота.
Используйте типсы для экстерьера трех-пяти сантиметрового сегмента кишечника. Сделайте два небольших разреза в верхней и нижней части сегмента кишечника и ввещайте стеклянный микропипетт в кишечный люмен. Затем используйте электрокаутеризацию, чтобы открыть экстерьеризованный кишечный сегмент продольно вдоль анти-мезентерической стороны и разоблачить слизистую оболочку.
Промыть ткань кратко солевым раствором, чтобы удалить фекальное содержание. Для окрашивания поверхности слизистой оболочки кишечника нанесите 100 микролитров по миллиграмму на миллилитр акрифлавного раствора в каплях на облещенную слизистую поверхность и дайте пятно развиваться в течение трех минут, прежде чем промыть оставшийся раствор с помощью PBS. Затем нанесите 100 микролитров по два миллиграмма на миллилитр раствора декстрана в каплях к слизистой оболочке в течение трех минут инкубации перед стиркой с помощью PBS.
Затем поместите анестезированую мышь на крышку слайда, установленного на камеру промыть 37 градусов по Цельсию солевой раствор, регулируя положение, если это необходимо, и поместите препарат на перевернутой стадии микроскопа. Сразу после размещения мыши на сцене, включите источник света и отрегулируйте положение XY до тех пор, пока ось освещения не будет сосредоточена на подготовке тканей. Для того, чтобы выбрать поле зрения, выберите соответствующий куб фильтра.
Откройте затвор и используйте макро- и микрокоросла, чтобы сосредоточиться на поверхности слизистой оболочки кишечника. Отрегулируйте положение XY, чтобы найти область, в которой несколько вилли могут быть визуализированы в поле зрения и изменить куб фильтра, чтобы убедиться, что окрашивание родамина декстрана также видно в этой области. Когда область интереса была определена, начните приобретение изображения и выберите последовательность один, чтобы настроить мощность лазера, получить, и компенсировать для последовательности 1.
Затем выберите последовательность два и настроить мощность лазера, получить, и компенсировать для последовательности два. Чтобы определить диапазон «К-стек», откройте меню высадки стеков. Используйте управление доступом к q, чтобы сосредоточиться на поверхности слизистой оболочки и нажмите кнопку начать.
Сосредоточьтесь на нижнем пределе того, где сигнал все еще обнаруживается, и нажмите конец. Определите количество стеков, избегая промежуток времени более двух минут в течение двух последовательных временных точек и откройте меню времени, чтобы выбрать свести к минимуму и приобрести до остановки. Чтобы определить среднее значение строки, выберите один, строку в среднем два, искать два, и средняя строка два.
Затем, чтобы получить изображения, установите формат до 1024 х 1024 пикселей и скорость до 400 и нажмите кнопку запуска. Кишечные эпителиальные клетки конкретных GGTase недостаточно условных мышей разработаны тяжелые кишечные патологии, как попродемонстрировано увеличением гистологического ущерба оценка тонкой кишки и увеличение кишечной эпителиальной проницаемости также могут быть обнаружены с помощью трассировщика в in-vivo экспериментов с использованием устно вводят FITC-декстран. События пролития клеток могут быть определены как клетки, движущиеся из эпителиального монослоя в люмен, что приводит к временным зазорам в потолке эпителия, которые, наконец, закрыты контактом между соседними клетками, так называемый эффект молнии.
Эти пробелы наблюдаются как у контроля, так и у неудовлетворительных мышей GGTase, хотя частота этого явления выше у последних. Интересно, что другие клетки также, как представляется, поглощение dextran. Эти так называемые проницаемые клеточные события также происходят в основном у условного нокаутирующего мыша.
Иммуностетинирование цитоскелетных и жестких белков соединения, представляющих интерес, может быть выполнено для определения конкретных целей, которые способствуют потенциальным нарушениям эпителиальной проницаемости, определяемым с помощью интравитальной микроскопии. Этот метод может быть использован для анализа других явлений на поверхности слизистой оболочки кишечника, таких как эндотелиальная утечка или иммунная эпителиальная связь в контексте кишечной инфекции.
