Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области токсикологии насекомых и физиологии насекомых путем измерения электрогенеза центральной нервной системы Drosophila melanogaster. Это позволяет проверить широкий спектр научных гипотез и помочь в открытии новых инсектицидных способов действия. Основным преимуществом этой методики является то, что она обеспечивает простую, воспроизводимую и относительно высокую пропускную способность системы с минимальным финансовым вкладом для изучения нервной системы Дрозофилы.
Для начала откройте программное обеспечение для приобретения/анализа. Нажмите Настройка в основной панели инструментов, и выберите настройки канала, который откроет диалоговое окно. Сократите количество каналов до трех.
Первый канал будет записывать необработанный сигнал от усилителя с диапазоном 100 милливольт. Второй канал будет использоваться для подсчета количества событий первого канала, которые находятся выше данного порога. Для этого нажмите на вкладку «Расчет», чтобы открыть меню для второй канала.
Выберите циклические измерения, которые откроют второе диалоговое окно. Выберите первый канал в качестве источника. Затем, при измерении выпадают из меню, выберите Unit Spike at Events.
Наконец, в области настроек обнаружения из меню высадки выберите Simple Threshold. Пороговый уровень вводится в окно регулировки обнаружения, которое должно быть установлено выше фонового шума. Для преобразования электрической активности в тарифный участок, выраженный в герце, выберите арифметику на третьем канале.
На новом окне, вход 1000 раз smoothsec, скобки канал два запятой два. Затем выберите в меню высадки единиц частотный блок hertz. Закройте диалоговые окна, чтобы вернуться на главный экран.
Y-оси канала три должны быть выражены в герц и X-оси во времени. Рассекает личинку Drosophila CNS, сначала идентифицирует и извлекает блуждающий третий-instar Drosophila melanogaster из культурного флакона и помещая его в 200 микролитров солевого раствора. Затем схватите крючки для рта парой тонких типсов и схватите живот личинки второй парой типсов, с легким давлением, чтобы избежать разрыва тонкого какулярного слоя.
Аккуратно потяните рот крючки и живот в разные стороны, чтобы отделить хвостовой конец личинки от области головы и подвергать внутренности личинки. ЦНС будет переплетаться с трахеей и пищеварительным трактом. Дразнить ЦНС из пищеварительного тракта и трахеи с типсами.
Вскрытие центральной нервной системы Дрозофилы от личинки является критическим шагом для успеха. Вскрытые ганглии должны быть нетронутыми, без каких-либо значительных повреждений нисходящих моторных нервов. Большее количество моторных нервов, прикрепленных к ганглиям, увеличит базовые частоты стрельбы.
При необходимости, нарушить геммозеозно-мозговой барьер, вручную пересекая ЦНС задней мозговой доли с Ваннас весенние ножницы. Трансекция должна быть сделана на основе физиохимических свойств используемого химического вещества. Красная линия является предложенной точкой перегиба и трансектированная ЦНС с нетронутыми нисходящими стволами периферического нерва, показанными здесь.
Для начала сначала вытяните стеклянный электрод пипетки из борозиликатных стеклянных капилляров к сопротивлению от пяти до 15 мегаохм. Вставьте трансектированную ЦНС в восковую камеру, содержащую 200 микролитров солевого раствора. Зажим uncoated штырь насекомого с зажимом аллигатора припой к проводу земли, и вставьте штырь в солевой раствор для того чтобы завершить цепь.
Используя микроманипуляторы, ориентируйте электрод на хвостовой конец трансектированного ЦНС. Устраните фоновый шум, регулируя пороговый уровень в программном обеспечении приобретения/анализа до подключения стволов периферического нерва. Нанесите небольшое негативное давление на шприц, чтобы привлечь периферические нервы в всасывающий электрод.
Запустите запись на программном обеспечении для сбора данных и базовую скорость стрельбы, чтобы уравночные в течение пяти минут до сбора исходных данных скорости стрельбы. Через пять минут добавьте 200 микролитров солевого раствора и транспортного средства, чтобы довести общий объем камеры до 400 микролитров, чтобы начать запись показателей стрельбы. Откажитесь от подготовки и записи, если схема стрельбы контрольной обработки не похожа на пример, показанный здесь.
Когда базовый уровень был установлен после трех-пяти минут записи, снять 200 микролитров солевого раствора и добавить 200 микролитров экспериментального агента solubilized в солевой раствор. Этикетка на этот раз точки применения препарата в приобретении / анализ программного обеспечения, включив комментарий, который включает в себя препарат и окончательную концентрацию. Здесь показан репрезентативный след разряда нерва до и после контакта с DMSO.
Стрелка указывает время применения. Наблюдается ограниченный ответ на DMSO. Увеличение дозы пропоксура усилило частоту сброса шипов трансектированного ЦНС Дрозофилы в зависимости от концентрации образом, в то время как нейродепрессант ГАМК снизил частоту сброса шипа в зависимости от концентрации образом.
При попытке этой процедуры, важно помнить, что это эксперимент ex vivo, и поэтому условия солевого раствора, такие как рН и температура, имеет решающее значение для длительной деятельности центральной нервной системы подготовки. Аналогичным образом, отсутствие посторонних электрической активности, эффективная клетка Фарадея, и снижение 60-герц шума имеют решающее значение для успеха этого анализа. Данные, собранные с помощью этого анализа, могут помочь определить конкретный способ действия инсектицидов.
Последующая проверка этих данных с помощью других методов, таких как электрофизиология напряжения, биохимический анализ и дополнительные фармакологические анализы могут быть выполнены.
