Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi della tossicologia degli insetti e della fisiologia degli insetti misurando l'elettrogenesi del sistema nervoso centrale Drosophila melanogaster. Ciò consente di testare una vasta gamma di ipotesi scientifiche e aiutare nella scoperta di nuove modalità d'azione insetticide. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un sistema semplice, riproducibile e relativamente ad alta produttività con un input finanziario minimo per studiare il sistema nervoso della Drosophila.
Per iniziare, aprire il software di acquisizione/analisi. Fare clic su Imposta sulla barra degli strumenti principale e selezionare Impostazioni canale, che aprirà una finestra di dialogo. Ridurre il numero di canali totali a tre.
Il canale uno registrerà il segnale grezzo dall'amplificatore con un intervallo di 100 millivolt. Il canale due verrà utilizzato per contare il numero di eventi dal canale uno che sono al di sopra di una determinata soglia. A tale proposito, fare clic sulla scheda Calcolo per aprire un menu a discesa per il canale due.
Selezionate Misure cicliche (Cyclic Measurements), che aprirà una seconda finestra di dialogo. Selezionare il canale uno come origine. Quindi, nella misurazione del menu a discesa, selezionare Unit Spike at Events.
Infine, nell'area delle impostazioni di rilevamento, scegliere Soglia semplice dal menu a discesa. Il livello di soglia viene immesso nella finestra di regolazione del rilevamento da impostare sopra il rumore di fondo. Per convertire l'attività elettrica in un plottaggio di velocità espresso in hertz, selezionate Aritmetica (Arithmetic) sul terzo canale.
Nella nuova finestra, input 1000 volte smoothsec, parentesi canale due virgola due. Quindi, selezionare nel menu a discesa delle unità l'unità di frequenza hertz. Chiudere le finestre di dialogo per tornare alla schermata principale.
L'asse y del canale tre dovrebbe essere espresso in hertz e l'asse x nel tempo. Sezionare il SNC larvale Drosophila identificando ed estraendo prima una Drosophila melanogaster vagante della terza instar dalla fiala di coltura e collocandolo in 200 microlitri di soluzione salina. Quindi, afferrare i ganci della bocca con un paio di forcep fini e afferrare l'addome del verme con un secondo paio di forcep, con pressione leggera, per evitare di strappare il sottile strato cuticolare.
Tirare delicatamente i ganci della bocca e l'addome in diverse direzioni per separare l'estremità caudale del verme dalla regione della testa ed esporre i visceri del verme. Il SNC si intreccierà con la trachea e il tratto digestivo. Prendere in giro il SNC dal tratto digestivo e dalla trachea con le forcep.
La dissezione del sistema nervoso centrale Drosophila dal verme è un passo fondamentale per il successo. I gangli sezionati devono essere intatti, senza danni significativi ai nervi motori discendenti. Un maggior numero di nervi motori attaccati ai gangli aumenterà le frequenze di fuoco di base.
Se necessario, interrompere la barriera eto-encefalica trasmetta manualmente il SNC posteriore ai lobi cerebrali con le forbici a molla Vannas. La trasezione deve essere effettuata in base alle proprietà fisiochimiche della sostanza chimica utilizzata. La linea rossa è il punto di trasezione suggerito e il SNC trasetto con tronchi nervosi periferici discendenti intatti mostrati qui.
Per iniziare, prima tirare l'elettrodo di pipetta di vetro dai capillari di vetro borosilicato a una resistenza da cinque a 15 megaohms. Inserire il SNC trasetto in una camera di cera contenente 200 microlitri di soluzione salina. Bloccare un perno insetto non rivestito con una clip di alligatore saldata al filo di terra e inserire il perno nella salina per completare il circuito.
Utilizzando i micromanipolatori, orientare l'elettrodo verso l'estremità caudale del SNC trasetto. Eliminare il rumore di fondo regolando il livello di soglia nel software di acquisizione/analisi prima di collegare i tronchi nervosi periferici. Applicare una leggera pressione negativa sulla siringa per attirare i nervi periferici nell'elettrodo di aspirazione.
Avviare la registrazione sul software di acquisizione dati e il tasso di attivazione di base per equilibrare per cinque minuti prima di raccogliere i dati del tasso di attivazione di base. Dopo cinque minuti, aggiungere 200 microlitri di soluzione salina e veicolo per portare il volume totale della camera a 400 microlitri per iniziare a registrare i tassi di cottura di controllo. Scartare la preparazione e la registrazione se il modello di cottura del trattamento di controllo non è simile all'esempio mostrato qui.
Quando il basale è stato stabilito dopo tre o cinque minuti di registrazione, prelevare 200 microlitri di salina e aggiungere 200 microlitri dell'agente sperimentale solubilizzato in salina. Etichettare questo punto di tempo di applicazione del farmaco nel software di acquisizione / analisi includendo un commento che include il farmaco e la concentrazione finale. Qui è mostrata una traccia rappresentativa della scarica nervosa prima e dopo l'esposizione al DMSO.
La freccia indica l'ora di applicazione. Si vede una risposta limitata al DMSO. L'aumento delle dosi di propoxur ha amplificato la frequenza di scarica del picco del SNC Drosophila trasetto in modo dipendente dalla concentrazione, mentre il GABA neurodepressivo ha ridotto la frequenza di scarica del picco in modo dipendente dalla concentrazione.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che si tratta di un esperimento ex vivo, e quindi le condizioni della soluzione salina, come pH e temperatura, sono fondamentali per l'attività prolungata della preparazione del sistema nervoso centrale. Allo stesso modo, la mancanza di attività elettrica estranea, un'efficace gabbia di Faraday e una riduzione del rumore di 60 hertz sono fondamentali per il successo di questo saggio. I dati raccolti attraverso questo saggio possono aiutare a identificare la modalità specifica di azione degli insetticidi.
È possibile eseguire la successiva convalida di questi dati attraverso altri metodi come l'elettrofisiologia tensione-morsetto, le analisi biochimiche e ulteriori test farmacologici.
