Diese Methode kann helfen, schlüsselhafte Fragen in den Bereichen Insektentoxikologie und Insektenphysiologie zu beantworten, indem sie die Elektrogenese des Drosophila melanogaster Zentralnervensystems misst. Dies ermöglicht es, eine breite Palette von wissenschaftlichen Hypothesen zu testen und bei der Entdeckung neuer Insektizid-Wirk-Modi zu helfen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es ein einfaches, reproduzierbares und relativ hohes Durchsatzsystem mit minimalem finanziellen Input bietet, um das Nervensystem von Drosophila zu studieren.
Öffnen Sie zunächst die Erfassungs-/Analysesoftware. Klicken Sie in der Hauptsymbolleiste auf Setup, und wählen Sie Kanaleinstellungen aus, wodurch ein Dialogfeld geöffnet wird. Reduzieren Sie die Anzahl der Gesamtkanäle auf drei.
Kanal eins zeichnet das Rohsignal des Verstärkers mit einem Bereich von 100 Millivolt auf. Kanal zwei wird verwendet, um die Anzahl der Ereignisse von Kanal 1 zu zählen, die einen bestimmten Schwellenwert überschreiten. Klicken Sie dazu auf die Registerkarte Berechnung, um ein Dropdown-Menü für Kanal 2 zu öffnen.
Wählen Sie Zyklische Messungen aus, wodurch ein zweites Dialogfeld geöffnet wird. Wählen Sie Kanal eins als Quelle aus. Wählen Sie dann im Dropdown-Menü die Option Einheitenspitze bei Ereignissen aus.
Wählen Sie schließlich im Bereich der Erkennungseinstellungen im Dropdown-Menü Einfache Schwelle aus. Der Schwellenwert wird im Erkennungsanpassungsfenster eingegeben, das über Hintergrundrauschen eingestellt werden soll. Um die elektrische Aktivität in ein in Hertz ausgedrücktes Ratediagramm umzuwandeln, wählen Sie Arithmetik auf dem dritten Kanal aus.
In dem neuen Fenster, Eingabe 1000 mal smoothsec, Klammern Kanal zwei Komma zwei. Wählen Sie dann im Dropdown-Menü Einheiten die Frequenzeinheit Hertz aus. Schließen Sie die Dialogfelder, um zum Hauptbildschirm zurückzukehren.
Die y-Achse von Kanal drei sollte in Hertz und die x-Achse in der Zeit ausgedrückt werden. Sezieren Sie die Larven Drosophila CNS durch die erste Identifizierung und Extraktion eines wandernden Dritten-Instar Drosophila melanogaster aus der Kultur-Fläschchen und legen Sie es in 200 Mikroliter Saline. Greifen Sie dann die Mundhaken mit einem Paar feiner Zange und greifen Sie den Bauch der Made mit einem zweiten Paar Zange, mit leichtem Druck, um zu vermeiden, dass die dünne Schnittschicht reißt.
Ziehen Sie die Mundhaken und den Bauch vorsichtig in verschiedene Richtungen, um das kaudale Ende der Maden vom Kopfbereich zu trennen und die Eingeweide der Maden freizulegen. Das ZNS wird mit der Luftröhre und dem Verdauungstrakt verflochten sein. Tease das ZNS aus dem Verdauungstrakt und Luftröhre mit Zange.
Die Zerlegung des Drosophila-Zentralnervensystems von der Made ist ein entscheidender Schritt für den Erfolg. Die sezierten Ganglien müssen intakt sein, ohne nennenswerte Schäden an den absteigenden Motornerven. Eine größere Anzahl von Motornerven, die an den Ganglien befestigt sind, erhöht die Grundfeuerfrequenzen.
Bei Bedarf stören Sie die Blut-Hirn-Schranke, indem Sie das ZNS-Hinterteil manuell mit einer Vannas-Federschere auf die Hirnlappen übertragen. Die Transektion sollte auf der Grundlage der physiochemischen Eigenschaften der verwendeten Chemikalie durchgeführt werden. Die rote Linie ist der vorgeschlagene Transektionspunkt und das transektierte ZNS mit intakten absteigenden peripheren Nervenstämmen, die hier gezeigt werden.
Zunächst ziehen Sie zunächst die Glaspipettenelektrode aus Borosilikatglaskapillaren auf einen Widerstand von fünf bis 15 Megaohm. Setzen Sie das transsektierte ZNS in eine Wachskammer mit 200 Mikroliter naline. Klemmen Sie einen unbeschichteten Insektenstift mit einem Alligatorclip, der an den Erddraht gelötet ist, und stecken Sie den Stift in die Saline, um den Kreislauf abzuschließen.
Mit den Mikromanipulatoren orientieren Sie die Elektrode am kaudalen Ende des transectierten ZNS. Eliminieren Sie Hintergrundgeräusche, indem Sie den Schwellenwert in der Erfassungs-/Analysesoftware vor dem Anschluss der peripheren Nervenstämme anpassen. Tragen Sie leichten Unterdruck auf die Spritze auf, um periphere Nerven in die Saugelektrode zu ziehen.
Starten Sie die Aufzeichnung auf der Datenerfassungssoftware und die Basisauslaufrate, die fünf Minuten lang ausgeglichen werden soll, bevor Basiswertdaten für die Brennrate gesammelt werden. Fügen Sie nach fünf Minuten 200 Mikroliter Saline und Fahrzeug hinzu, um das Gesamtvolumen der Kammer auf 400 Mikroliter zu erhöhen, um mit der Erfassung der Feuerraten zu beginnen. Entsorgen Sie die Zubereitung und Aufzeichnung, wenn das Muster des Abfeuerns der Kontrollbehandlung nicht dem hier gezeigten Beispiel ähnelt.
Wenn die Ausgangsbasis nach drei bis fünf Minuten Aufnahme festgelegt wurde, ziehen Sie 200 Mikroliter Saline ab und fügen Sie 200 Mikroliter des in Deraline löslichen Versuchsmittels hinzu. Kennzeichnen Sie diesen Zeitpunkt der Arzneimittelanwendung in der Erwerbs-/Analysesoftware, indem Sie einen Kommentar einschließen, der das Medikament und die endgültige Konzentration enthält. Hier ist eine repräsentative Nervenentladungsspur vor und nach der Exposition gegenüber DMSO zu sehen.
Der Pfeil gibt die Zeit der Anwendung an. Eine begrenzte Reaktion auf DMSO wird gesehen. Steigende Dosen von Propoxur verstärkten die Spike-Entladungshäufigkeit des transsektierten Drosophila ZNS in einer konzentrationsabhängigen Weise, während das Neurodepressivum GABA die Spike-Entladungshäufigkeit in einer konzentrationsabhängigen Weise reduzierte.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass es sich um ein Ex-vivo-Experiment handelt, und daher sind die Bedingungen der Saline, wie pH und Temperatur, entscheidend für eine längere Aktivität der Vorbereitung des zentralen Nervensystems. In ähnlicher Weise sind der Mangel an fremder elektrischer Aktivität, ein effektiver Faraday-Käfig und eine Reduzierung von 60-Hertz-Rauschen entscheidend für den Erfolg dieses Assays. Die durch diesen Test gesammelten Daten können helfen, die spezifische Wirkungsweise von Insektiziden zu identifizieren.
Anschließend können diese Daten durch andere Methoden wie Spannungsklemmenelektrophysiologie, biochemische Analysen und zusätzliche pharmakologische Assays validiert werden.
