Экстра-генная терапия и аутологичная трансплантация клеток для лечения врожденных ошибок обмена веществ в печени является важной альтернативой терапии этих расстройств. И позволяет нам не только лечить эти расстройства, но выяснить биомассу, необходимую для достижения терапевтического результата. Такой подход также позволяет избежать значительных последствий иммуносупрессии и других последствий с различными видами терапии.
В данном контексте мы используем этот подход для лечения наследственной тирозинемии типа 1. Тем не менее, идея заключается в том, что это будет платформенный подход для лечения множества различных заболеваний печени с минимальными изменениями. Важно, чтобы иметь возможность визуализировать этот метод, потому что есть некоторая изменчивость, когда дело доходит до визуализации эффективности перфузии, которая имеет важное значение для получения жизнеспособных гепатоцитов для трансплантации.
Хирургическая процедура в исполнении Роберта Кайзера и Джозефа Лиллегарда. Изоляция клеток в исполнении Зедзи Ду, Брюса Амиота. Очистка клеток UAU и экс-виво трансдукция клеток была сделана Кейтлин ВанЛит.
Подготовка животных и OR подготовка была сделана Кари Аллен и Лори Хиллин. Для выполнения первоначального входа в порт, выполнить открытую технику Hasson головки для umbilicus анестезированной, до трех месяцев, большой, белый свиньи фермы. Представляем 12-миллиметровый трокар в брюшную полость, где виден брюшной полости.
Когда трокар на месте, пройти 5 миллиметров 30 градусов области через порт входа и insufflate живота с углекислым газом до 15 миллиметров ртути. Под прямую визуализацию с лапароскопической камерой, поместите 2 дополнительных 5 миллиметровых портов, триангуляции на левой боковой доли печени. И поместите лапароскоп в один из новых портов.
Определите левый боковой сегмент печени в точке основной трещины левой доли, которая отделяет медиальный и левый боковой сегменты. И использовать хирургический степлер для обеспечения сосудистых структур и печеночным вены вдоль этой трещины. Трансект parenchyma через эту трещину с помощью последовательных стрельб и 60, 45, или 30 миллиметров длиной сосудистых нагрузок.
Когда ресекция завершена, оценить остатки печени, чтобы обеспечить адекватный гемостаз и использовать эндоскопические захваты и эндоскопической ткани поиска мешок для получения печени разделе. Теперь удалите порты и используйте прерванный нулевой размер шва для фасции средней линии. Бегущий 2-0 шов для глубокого дермального слоя.
И работает 4-0 шва для подкожного слоя, чтобы закрыть 12 миллиметровый разрез порта в трех слоях. Затем закройте пятимиллиметровые порты одним слоем с 2-0 швами. И поместите стерильную повязку на разрезы.
Для изоляции гепатоцитов сначала подключите перисталтический насос, установленный для доставки дисперсионных растворов, поддерживаемых в водяной бане 43 градусов по Цельсию, к катетерам, которые помещаются в большие открытые сосуды секции печени. Премьер насоса и трубки с перфузией два раствора, до остановки петух позиции переключаться между перфузией один и перфузии два решения доставки в ткань. И переключить стоп петух на перфузии одной позиции.
Затем премьер остальной части трубки набора. Полностью заполнение вкольной ловушки, чтобы предотвратить введение пузырьков воздуха в ткани. Далее сделайте чистый поперечный разрез, перпендикулярно печеночным кровообращением, чтобы выявить поперечные сечения ветвей вен портала и печеночным венам для катетеризации.
И использовать уютный установки катетера для катетеризации доступных, открытых вен. Когда катетеры на месте, perfuse повторной ткани печени с теплой перфузии один раствор на 100 миллиметров в минуту скорость потока. Перемещение розетки трубки из вены в вену каждые 30 до 60 секунд.
И с помощью эвакуационные трубки, чтобы удалить избыток буфера из ткани лоток. После езды на велосипеде по всем доступным венам в течение 15-20 минут, переключитесь на перфузию два раствора при одинаковых условиях. Использование обратного насоса для переработки перфузии два раствора обратно в резервуар, на более медленной скорости потока, для повторного введения в ткани.
Проверьте температуру поверхности пузырь ловушку и, или печени примерно каждые пять минут, чтобы подтвердить, что гепатоциты не остыть. Когда печень бланширует примерно через 30 минут перфузии, перенесите ткань в стерильный контейнер, завернутый в стерильную драпировку, и поместите контейнер в капюшон клеточной культуры для поддержания стерильности во время обработки гепатоцитов. Коллагеназа изоляции гепатоцитов и диссоциации клеток должно быть сделано полностью, так что вы не получите слипания клеток, что снижает жизнеспособность клеток и частоты трансдукции.
Погрузить печень с гепатоцитов мыть среды и перетащить ножницы через верхнюю часть ткани, чтобы нарушить капсулу печени. Надев стерильные перчатки, нежно массируйте печень, чтобы выпустить гепатоциты в среду. И фильтровать ткань supernatant, через стерильную марлю, в 200 миллилитров центрифуги бутылки.
Соберите отфильтрованные гепатоциты путем центрифугации. Объединение клеток в 150 миллилитров свежих гепатоцитов мыть среды в одну бутылку 200 миллилитров для 2 дополнительных моет. И подсчет клеток после третьей центрифугации.
Затем разбавить клетки до 1 раза от 10 до девятого гепатоцитов на миллилитр солевой концентрации. Для аутотрансплантации изолированных гепатоцитов используйте двух-пять мегагерц-предуцеров для идентификации вены портала с помощью ультразвука и навемите пятидюймовую иглу 18-го калибра к главной вене портала, приближенной к ее бифуркации. Загрузите клетки в 60-миллилитровый шприц, в зависимости от общего объема клеток и прикрепите шприц к игле, заботясь о том, чтобы не вводить пузырьки.
Далее, медленно угнетайте поршень шприца, чтобы вручную влить до 1 раза 10 до девятого гепатоцитов через портальный вены с помощью инфузионного катетера для мониторинга порального давления во время трансплантации. Когда все клетки были доставлены, удалить катетер и контролировать портал вены на наличие тромботических событий и вперед потока с помощью ультразвука. В репрезентативной когорте из пяти свиней, которые подверглись печеночным ресекции, большинство из них имели урожайность от более чем 10 до девятого гепатоцитов с примерно 80%жизнеспособности.
Обеспечение достаточного количества клеток для любого типа желаемых манипуляций, включая генную терапию. Последующая культура не пересаженной части этих подготовленных гепатоцитов продемонстрировала хорошую жизнеспособность и адгезию с типичной морфологией гепатоцитов через 46 часов после их трансдукции и первоначального покрытия. Первоначальная при пересадка будет варьироваться в зависимости от количества клеток, восстановленных во время трансплантации.
Эти репрезентативные биопсии демонстрируют хронологию расширения клеток, исправленных генами. Уникальный для заболеваний, таких как наследственная тирозинемия типа 1, которые пользуются положительным выбранным давлением для здоровых клеток. Это расширение обычно завершается через 12 месяцев после трансплантации.
После пересадки фумарилакетоацетат гидролаза нокаут животных достигло около 20% повторной популяции исправленных гепатоцитов в печени, уровни тирозина нормализуются по сравнению с дикими животными типа. В то время как неисправленные животные демонстрируют значительную высоту как в щелочной фосфатазе, так и в трансаминазе аспартата по сравнению с животными дикого типа, генная терапия ex vivo возвращает эти уровни ферментов сыворотки в нормальное русло. Кроме того, общее метаболическое здоровье печени нарушается в необработанных свиней нокаут, как указано на высотах в циркулирующих аммиака, которые корректируются после повторной популяции с обработанными гепатоцитами.
Важно помнить, с помощью этой техники для обработки и манипулировать ткани тщательно и как можно меньше. Повышенная обработка или манипуляция тканями, приводит к снижению жизнеспособности клеток и снижению урожайности. Этот подход также может быть применим для людей, которые заинтересованы в изучении распределения лука и график неэффективности в методах маркировки, используя другие методы за пределами вирусных протоколов трансдукции.
Не забывайте, что работа с вирусными переносчиками может быть опасной, поэтому при использовании этих методов необходимо следовать надлежащим процедурам биобезопасности, а также носить средства индивидуальной защиты.
