Основным преимуществом этого анализа мутности на основе пластины является то, что он быстр и позволяет проверять сразу несколько ингибиторов взаимодействия амилоидно-бета фибриногена без сложной настройки или требований. Головные соединения, которые находятся в анализе мутности фибрина, могут быть дополнительно оценены за их способность восстановить А-бета-индуцированной структурной аномалии в сгустках фибрина, проанализированных путем сканирования электронной микроскопии. Визуальная демонстрация подготовки сгустка для сканирования анализа электронной микроскопии имеет решающее значение, поскольку любые изменения в препарате могут способствовать вариациям в экспериментальных результатах.
Основное внимание в этой демонстрации здесь уделяется A-бета фибриноген взаимодействий. Этот протокол можно легко модифицировать для анализа других взаимодействий с другими белками и соединениями с сгустком фибрина. Начните с добавления 1,5 микромолара свежеприготовленного фибриногена в 200 микролитров буфера образования тромбов к каждому A-бета отрицательному 42, содержащем и контролю скважин и инкубировать пластину на вращающейся платформе при комнатной температуре.
Через 30 минут одновременно добавьте 30 микролитров свежеприготовленного раствора тромбина непосредственно в центр фибриногенсодержащего хорошо, чтобы инициировать образование тромба и сразу же прочитайте поглощение тромбов in vitro на 350 нанометров, повторяя измерение каждые 30-60 секунд в течение 10 минут. Для оценки влияния ингибиторов взаимодействия A-beta fibrinogen на структуру сгустка фибрина, сначала используйте типсы, чтобы поместить чистый, 12-миллиметровый силиконовый стеклянный круг крышка скользит к отдельным скважинам 12 пластины скважины и добавить 80 микролитров фибриногена на каждой крышке скольжения, мягко распространяя раствор так, что они равномерно распределены. Добавьте 20 микролитров раствора тромбина в каждую колодец, чтобы инициировать образование тромбов.
Обложка пластины в течение 30 до 60 минут инкубации при комнатной температуре, а затем осторожно погрузить каждый сгусток в два миллилитров ледяного буфера какодилата натрия в течение двух минут, покрытые, при комнатной температуре в два раза, используя один миллилитр пипетки тщательно удалить буфер после каждой стирки. После последней стирки проверьте состояние образования сгустка на крышке скольжения и исправить сгустки в два-три миллилитров ледяной 2%glutaraldehyde на льду в течение 30 минут. В конце инкубации аккуратно удалите глутаралдегид из каждого хорошо и мыть сгустки со свежим буфером какодилата натрия, как попродемонстрировано на льду.
Для увлажнения фиксированных сгустков в градуированной серии из пяти минут ледяного этанола моет на льду, не полностью удаляя этанол между моет держать сгустки защищены от воздействия воздуха. Во время последнего 100%ethanol мыть, передача крышка скользит в критической точке сушилки образца держателя, размещение по крайней мере 1 шайба между каждой крышкой скольжения и место держателя в критическую точку сушилки камеры заполнены этанолом. После 30-минутного цикла сушки используйте углеродную ленту для установки крышки скользит по отдельным сканирующей электронной микроскопии заглушек и передачи образцов в камеру покрытия распыления вакуумного распылитель.
Затем распыление пальто менее 20 нанометров золотого палладия или других проводящих материалов на образцы в течение 25 секунд при четырех ангстремах в секунду и изображение образцов на сканирующем электронном микроскопе, оборудованном детектором вторичных электронов типа два на четыре киловольты. Образование сгустка Фибрина вызывает рассеяние света, проходящего через раствор, что приводит к повышенной мутности, что плато в конце периода чтения. Когда фибриноген инкубируется в присутствии A-beta 42 мутность раствора уменьшается с кривой, достигаемой максимальной высоты примерно в два раза, что фибриногена в одиночку.
При наличии блокатора взаимодействия A-beta 42 эффект бета-амилоида омлеяется, а мутность выше, чем при одной только А-бета. Эффект блокатора не появляется из-за фоновой мутности, так как соединение не меняет мутность сгустка фибрина, когда отсутствует A-бета. Кроме того, образование тромбов в присутствии GPRP, пептида, который, как известно, мешает полимеризации фибрина, демонстрирует значительно сниженную мутность по сравнению с образованием сгустка фибрина в отсутствие ингибитора.
Фибриноген, генерируемый при наличии тромбина и хлорида кальция, образуют только фибриновую сетку с удлиненными и интеркалированными нитями фибрина, а также более крупными пучками. Когда A-бета присутствует, нити фибрина стали тоньше с несколькими липкими сгустками в агрегатах, что указывает на А-бета индуцированных структурных аномалий. В соответствии с результатами анализа мутности, образование тромба в присутствии блокатора взаимодействия A-beta fibrinogen частично восстанавливает структуру сгустка фибрина от изменений, вызванных А-бета, поскольку с помощью этого лечения наблюдается меньше комков.
Анализ мутности сгустка и протоколы анализа электронного микроскопа были оптимизированы для оценки нескольких ингибиторов взаимодействия фибриногена A-бета быстрым и воспроизводимым образом. И вскоре данные предоставят ценную информацию о образовании сгустка фибрина, которая может быть применена к дальнейшим исследованиям как in vitro, так и in vivo.
