Этот протокол позволяет нарезать семена неповрежденными, чтобы они не рассыпались, что позволяет визуализировать гранулы крахмала в любом семени, которое может поместиться в кончик пипетки. Податливый пластиковый конус поддерживает нативную структуру сухих тканей и органов, поэтому это дешевое и легкое многообразие позволяет обрабатывать многие образцы за короткое время. Чтобы перейти от преимущества судебной микроскопии здесь, устойчивого крахмала, того, что мы все ищем, доступности ферментов к этому сырому крахмалу, амилолизу, гликемическому индексу и всплескам глюкозы, это основные параметры для разведения лучших сортов риса для борьбы с диабетом 2 типа во всем мире сегодня.
А теперь очень приятно представить вам доктора Киа Бартона. Доктор Бартон из нашей лаборатории, и она будет использовать основной центр визуализации факультета, чтобы показать вам, как эта техника используется. Начните с удаления шелушения сухих ядер.
Поместите одно ядро на плоскую резиновую пробку на рабочем столе и убедитесь, что эта пробка остается неподвижной. Используйте вторую плоскую резиновую пробку, чтобы истирать ядро, скручивая его против первой резиновой пробки, затем удалите шелуху с ядра, заботясь о том, чтобы не разрушить эндосперм и не измельчить семена слишком агрессивно между двумя резиновыми бугами. Удалите оставшуюся шелуху с помощью мелких щипцов и вставьте отдельное ядро шелухи в пластиковый наконечник пипетки объемом 250 микролитров.
Убедитесь, что эмбриональный конец ядра обращен к коническому концу кончика пипетки. Вставьте второй 250-микролитровый наконечник пипетки, чтобы заставить ядро врезаться в первый наконечник пипетки и сохранить ядро неподвижным во время сечения, следя за тем, чтобы не повредить ядро или не согнуть второй наконечник пипетки. Положите наконечник пипетки на верстак и держите его на месте вручную.
Другой рукой используйте острое лезвие скальпеля, чтобы разрезать центр ядра, отрезав конец кончика пипетки. Нарежьте вниз сборку, а затем направьте лезвие скальпеля вертикально, чтобы две новые открытые грани ручной секции были параллельны. Затем с помощью скальпеля вырежьте сантиметровые участки рисового ядра.
Чтобы выполнить микроскопию отраженного света, поместите поперечные рисовые срезы на кусок черной бумаги тяжелого калибра. Получение световых изображений поперечных срезов осуществляется с помощью стереомикроскопа с установленными гусиными шеями для наклонного освещения, используя не менее 10-кратного увеличения. Участки диких типов Nipponbare и ssg1 были исследованы под 260 раз, 920 раз и в 4 200 раз увеличениями.
При правильном приготовлении рисовые срезы были толщиной примерно 0,9 миллиметра с минимальным разрушением эндосперма и неповрежденных слоев околоплодника и алевронов. Этот метод позволяет получать срезы достаточного качества для наблюдения за всей эндоспермальной клеткой, составными гранулами крахмала и отдельными субгранулами. Производители полупрозрачных ядер, такие как гибридная линия устойчивого крахмала дикого типа Zhehui 7954 и мутант RS111, генерируемый кобальтом, произвели плотно упакованные многогранные гранулы крахмала, которые являются нормальным фенотипом эндосперма риса.
На изображениях SEM производителей меловых ядер, коммерческих сортов Ye Tang и RS4, были показаны гранулы крахмала, которые были круглыми и свободно упакованными. Дикий тип Xiushiu 11 и его мутант KMD1, который экспрессировал ген Cry1Ab для ингибирования хищничества насекомых, имели срезы и морфотипы эндосперма, похожие на полупрозрачные устойчивые крахмальные линии. Этот метод может быть применен к семенам других видов.
Модель монокота, Brachypodium distachyon, производит очень твердые семена, но все же удалось получить неповрежденное поперечное сечение. Неповрежденные поперечные сечения также были изготовлены из мягкой белой озимой пшеницы. Этот быстрый, дешевый метод скрининга для поиска внутри биологических структур может быть применен к ногам насекомых, шипам бобовых локусов, боярышникам, шипам рыб или любой области судебной микроскопии, которая может извлечь выгоду из этой установки поддержки образцов.
После выполнения этого протокола напыляемое покрытие для электромикроскопии, окрашивание специфическими флуоресцентными красителями и нанесение кальциватора для окрашивания для толщины клеточной стенки бета-глюкана в мутантных линиях овса и ячменя являются некоторыми быстрыми способами приближения к селекции растений с быстрым скринингом фенотипа.
