Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области эндотелиальной биологии, например, почему кровеносные сосуды имеют региональные различия в развитии атеросклероза? Основным преимуществом этой техники является то, что она позволяет одновременно изучать множественные состояния при стрессе стрижки или множественных снятиях. Последствия этого метода распространяются на понимание эндотелиальной регуляции генов как в артериальной, так и в венозной системах, поскольку могут использоваться различные скорость потока и закономерности.
Ну вот, мы демонстрируем систему, которая использует устойчивый поток ламинара. Настройка может быть адаптирована для других шаблонов потока, включая нарушенный поток. Как правило, люди, новые для этого метода будет бороться, чтобы сохранить непрерывный монослой клеток на протяжении всего эксперимента и получить последовательные результаты между экспериментами.
За 24 часа до анализа, подсчитайте человеческие эндотелиальные клетки на раннем проходе и семя примерно один раз от 10 до шестой клетки в одном миллилитре среды на один фибронектин покрытием стеклянной слайд на колодец из четырех хорошо пластины клеточной культуры. Разрешить клетки придерживаться слайда в течение 15 минут при 37 градусов по Цельсию. Затем накройте каждую горку тремя миллилитров среды и поместите пластину в инкубатор клеточной культуры 37 градусов по Цельсию и 5%CO2 в течение 24 часов.
В день эксперимента заполните поднос для воды большой, нагретой, встроенной среды с регулируемым CO2 и теплом, или пляжный инкубатор, с несколькими полками, внутренним доступом к электричеству и стеклянными дверями, и подтвердите, что для эксперимента имеется адекватный углекислый газ и что монитор CO2 функционален. Чтобы настроить камеру потока, вставьте 1/8-дюймовую женскую приманку в один конец мягкой трубки номер 16 и прикрепите четырехмерный стопкок к приманке. Прикрепите свободный конец трубки к стороне притока верхней пластины и вставьте 1/8-дюймовый мужской приманки в один конец второго числа 16 мягкой трубки.
Прикрепите четырехдневный стопкок к мужской приманке и прикрепите свободный конец трубки к стороне оттока верхней пластины. Вставьте 1/8-дюймовый мужской приманки и 1/8-дюймовый женский приманки в каждом конце третьего числа 16 мягкой трубки, и прикрепить трубки к пузырь ловушку через 1/8-дюймовый мужской приманки. Затем прикрепите четырехдневный стопкок к другому концу трубки через женскую приманку.
Используя стерильные пинцеты, перенесите одну клетку семян стекла слайд на углубление на нижней пластине, клетки посеяны вверх. Используйте 10 миллилитров шприц, чтобы добавить 10 миллилитров теплой среды к нижней пластине в красной линии прокладки вокруг пластины. Позволяет среде течь через слайд и покрывать клетки.
Аккуратно поместите верхнюю пластину на нижнюю пластину, заботясь, чтобы выровнять стороны и винт пластины вместе плотно. Чтобы удалить пузырьки воздуха из пузырь ловушки, сначала откройте приток и пузырь ловушки стопкок и закрыть отток стопкок. Затем используйте 30 миллилитров шприц, чтобы аккуратно промыть 20 миллилитров теплой среды через пластину.
Чтобы удалить пузырьки из камеры, закройте пузырь ловушку стопкок и открыть отток стопкок. Поднимите сторону оттока камеры до 45-градусного угла и используйте 30 миллилитровый шприц, чтобы аккуратно промыть 20 миллилитров теплой среды со стороны притока камеры. Важно промыть с соответствующей скоростью в направлении потока и использовать микроскоп, чтобы подтвердить, что слияние монослой клеток остается, прежде чем подвергать клетки ламинарного потока.
Затем закройте стоп-cocks по обе стороны от камеры и крышка и подтвердить, что клетки по-прежнему прилагается к слайду под световым микроскопом. Поместите камеру потока и ранее собранную систему петли потока на пляж и медленно уменьшите скорость насоса сборки петли потока перед полной паузой насоса. Закройте стоп-cocks на системе цикла потока для того чтобы предотвратить утечку и соединить камеру и систему петли совместно через stopcocks.
Когда все петли были подключены, вновь открыть все стоп-cocks и медленно увеличить скорость насоса при мониторинге установки для любой утечки или блокировки. Поместите датчик потока на камерный мост трубки притока стороне камеры с датчиком, ориентированным в направлении потока и настроить скорость насоса, чтобы получить скорость потока для скорости напряжения стрижки процентной ставки. Затем включите резервуар CO2, чтобы достичь концентрации 5%C02.
Как только экспериментальный период потока завершен, медленно уменьшите скорость перистрального насоса до нуля и выключите питание. Быстро закройте все открытые стопкоуки и перенесите камеру и прилагаемую трубку с стопкоком с каждой стороны на чистую скамейку сверху. Тщательно отвинтить все винты, чтобы удалить верхнюю пластину и использовать пинцет иглы нос для передачи стекла слайд из нижней пластины в 100 миллиметров диаметром блюдо.
Вымойте слайд в 10 миллилитров холодного PBS и проверить клетки под микроскопом, чтобы подтвердить приверженность клеток и выравнивание в направлении потока. После аспирации PBS, перенесите слайд в чистую тарелку диаметром 100 миллиметров и добавьте 350 микролитров буфера лиза, дополненных 1/100th бета-меркаптоэтанола из комплекта извлечения РНК на слайд. Используйте полиэтиленовый клинковый скребок клеток, чтобы соскребать клетки со слайда и наклонить блюдо культуры тканей, чтобы буфер объединиться в нижней части.
Используйте типсы, чтобы удалить слайд и пипетку клетки лишатся в 1,5 миллилитровую трубку на льду. Затем добавьте 10 микролитров разбавленной РНК люциферазы в лизат клетки для изоляции и анализа РНК в соответствии со стандартными протоколами. Успешная линейность плазмиды люциферазы с использованием ферментов ограничения может быть подтверждена запуском переваренных продуктов на агарозном геле, а размер линейного продукта может быть подтвержден с помощью ДНК-лестниц и по сравнению с необрезанным плазмидным.
Производственные процессы могут привести к небольшим колебаниям высоты камеры, поэтому скорость потока должна быть рассчитана для каждой камеры для достижения того же стресса стрижки. Для экспериментов, включающих ламинарный стресс стрижки в эндотелиальных клетках млекопитающих, светлячок люцифераза РНК может быть использован в качестве экзогенного всплеска РНК в. Нормализация эндогенного эталонного гена, экзогенного эталонного гена и как эндогенных, так и экзогенных эталонных генов в совокупности дает аналогичные результаты.
Следует отметить, что в этих репрезентативных экспериментах с использованием двух одновременно работающих камер потока со стрессом стрижки на одном Паскале для каждого эксперимента, Круппель, как фактор два нокдауна через SI-РНК дали аналогичную эффективность нокдаун между проверенными биологическими образцами. При попытке этой процедуры важно помнить, чтобы установить даже монослой клеток на слайде и обильно системы цикла потока до присоединения камеры потока. После этой процедуры, другие методы, такие как секвенирование РНК, могут быть использованы для оценки экспрессии РНК генома широкой и других считывания, таких как ДНК и белок, могут быть использованы для дальнейшего молекулярного анализа.
После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области эндотелиальной биологии, чтобы исследовать связь между стрессом стрижки и ангиогенный потенциал в эндотелиальных клетках человека.
