Здесь мы представляем NET'U'T, полностью автоматизированный подход к количественной оценке NETS и изображений иммунофлюоресценции. Это поможет исследователям в создании сопоставимого анализа изображений на основе данных, генерируемых несколькими пользователями и условиями. Преимуществами этого метода являются простота использования, анализ одноклеточных данных, несколько критериев для оценки формирования NET и объективный анализ нескольких изображений.
Установка и открытие программного обеспечения для анализа. Самую модную версию можно найти в архиве Зенодо GitHub или на веб-сайте Лаборатории Нордонфельта. В вкладке настройки выберите папку источника для анализа, нажав на опцию get path в меню источника.
Выберите папку, содержащую последовательности изображений, которые будут проанализированы. Опять же, нажмите на опцию get path в целевом меню и выберите целевую папку для сохранения данных после анализа изображений. Далее, при использовании отдельных изображений канала, назовите папки канала так, чтобы канал ДНК соответствовал ядерному пятнам ДНК, а канал NET изображает пятно нейтрофиловой эластазы на изображениях.
Кроме того, назовите папку, содержащую файлы изображения управления, как контроль. Затем нажмите кнопку информации о загрузке изображения и загрузите метаданные изображения в программное обеспечение. Затем в подменю заказа канала выберите правильный порядок канала, содержащийся в изображениях.
Это помогает предотвратить случайные несоответствия. Теперь нажмите кнопку подготовки данных, чтобы получить основные свойства изображения из необработанных данных и преобразовать изображения. Преобразованные изображения будут отображаться в подменю типов образцов.
Нажмите на меню типа образца, выберите изображение из подменю и нажмите на отображение данных изображения для отображения изображений, разделенных на ДНК и нейтрофил внеклеточной ловушки, или NET канал, соответственно. Чтобы сегментировать ячейки в соответствующие каналы, выберите вкладку метода сегментации и выберите метод в подменю метода как для ДНК, так и для каналов NET. Метод сегментации по умолчанию настроен на адаптивный и является рекомендуемой настройкой.
Другие варианты доступны в программном обеспечении, включая глобальные края и chanverse. Был также включен вариант водораздела, который поможет провести различие между тесно расположенными ячейками или NETs. Также во вкладке сегментации нажмите на опцию управления сегментом.
Затем выберите PMA из подменю типа выборки и нажмите на пакетную опцию, чтобы начать сегментацию всех изображений, включенных в набор данных. Затем выберите изображения в меню типа образца и нажмите на кнопку данных изображения дисплея, чтобы визуализировать и проверить бинарные маски изображения как для ДНК, так и для масок NET, генерируемых после сегментации. Теперь, во вкладке анализа, нажмите на кнопку определения порога для анализа образцов управления.
Затем, с правой стороны, измените тип образца на PMA и нажмите кнопку свойства ячейки, чтобы завершить анализ стимулируемых образцов. Затем выберите изображение из подменю типа образца и нажмите кнопку отображения данных изображения для отображения наложения и количества ячеек и ячеек NET, образующих на изображении. Начните с выбора образца из подменю типа образца.
Индивидуальные изображения могут быть выбраны из подменю типа образца для анализа или вся партия изображений может быть проанализирована путем выбора варианта партии. После выбора нажмите кнопку анализа NETs для завершения анализа. Отрегулируйте критерии NET вручную, чтобы дать оптимальные результаты для данной выборки.
Сравните идентифицированные NETs с исходными изображениями для оценки качества идентификации. После завершения этого шага критерии NET могут применяться во всех изображениях в наборе данных. Любые изменения, внесенные в критерии NET, также одновременно применяются ко всем контрольных образцам.
Проинспектировать резюме данных в подменю данных ячейки, где отображается количество изображений, количество ячеек на изображение и процент NETs на изображение. Введите вкладку вывода для выбора и просмотра результатов. Изучите и сравните различные выводы данных, полученные в результате анализа контрольных и обработанных PMA образцов, выбрав форму вывода и нажав на кнопку результатов вывода.
Затем запустите файл таблицы данных результатов CSV для изучения одноклеточных данных и нажмите на файлы PDF результатов, чтобы визуализировать распределение области NET и соотношение ДНК к NET в образцах. Красная линия указывает пороговое значение на графиках. Наконец, нажмите на файл распределения bivariate результатов, чтобы определить область NET по сравнению с формой ДНК.
Здесь было проанализировано 15 изображений контрольных нейтрофилов и 15 изображений нейтрофилов, стимулируемых ПМА, менее чем за десять минут. Общее количество клеток было подсчитано, и процент клеток с нейтрофиловыми внеклеточными ловушками был определен с помощью автоматизированного метода количественной оценки, описанного в этой статье. Эти результаты показывают, что ПМА-стимулированные нейтрофилов имеют большую площадь, увеличение ядерной деформации, и более высокое соотношение ДНК к NET, чем контрольные образцы.
В сочетании с 3D-графиком образцы, стимулируемые ПМА, как правило, показывают области затягивания групп, чем контрольные образцы. При попытке процедуры важно помнить, что, хотя рабочий процесс был протестирован с использованием нескольких доноров, рекомендуется, чтобы пользователь должен принять решение о параметрах программного обеспечения надлежащим образом на основе индивидуального набора данных.
