Bu yöntem, nefroloji alanındaki hücre yüzeyproteininin proteinürik böbrek hastalığında değil, proteinürik tespüleden rolü ile ilgili anahtar soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin başlıca avantajları, hücre yüzeyi protein ihyasının in-vivo çalışmasını kolaylaştırması ve deney başına birden fazla proteinin analiz edilebilmiş olmasıdır. Bu yöntem glomerüler hücre yüzeyi ticareti hakkında bilgi sağlasa da, izolasyon teknikleri ile perfüzyona sahip ve erişilebilen diğer organ sistemlerine de uygulanabilir.
Parmak ucuna yanıt eksikliğini onaylayarak ve anestezili farenin ventral tarafını %70 izopropil ile dezenfekte ederek başlayın. Sternum pelvis deri ile bir medyan kesim yapmak ve karın fasya deri kaldırmak için cımbız kullanın. Karın orta hattının her iki tarafında deri kesin ve ksifoid için mesane karın kas tabakası ile bir orta yapmak.
Kasları dört çeyreğe bölmek için makas ve forceps kullanın ve hayvanların boynuna doğru üst iki kadranda güvenli iki cerrahi kelepçe kullanın. Bir diseksiyon mikroskobu altında hayvan yerleştirin ve visseral organları bir kenara taşımak için steril bir takas kullanın. Ince makas kullanarak, hepatik frenik bağ kesti.
Ince cerrahi cımbız kullanarak, renal arterlerin hepatik mezenterik arter branial etrafında bir dikiş yerleştirin. Ve aort çevresinde, böbrek arterlerine proksimal, böbreküstü bezinde. Fasya, yağ ve diğer doku distal aort ücretsiz.
Sonra, bifurkasyon yükseklikte vena kava ve aort kelepçe ve renal arterlerin aort distal etrafında başka bir dikiş yerleştirin. Proksimal aort sütür sıkılaştırmak için cımbız kullanın, kan akışını zayıflatan ve aort çapı küçük bir delik yarısı aort içine, böbrek arterlere distal kesti. Aort içine beş mililitre buz gibi pbs artı kalsiyum ve magnezyum içeren 10 mililitrelik bir şırıngaya bağlı 10 santimetrelik bir kateter yerleştirin.
Ve kateteri hazırlanan bağlarla düzeltin. Sonra dakikada iki mililitre akış hızında böbrekler perfüzyon başlar. Böbrek arterlerinde renal ven içine bir delik kesmek ve hepatik ve mezenterik arterler etrafında dikiş sıkma için ince makas kullanarak.
PBS tüm hacmi teslim edildikten sonra yüzey etiketleme için mililitre biotin başına 0,5 miligram ile desteklenen buz gibi pBS artı kalsiyum ve magnezyum beş mililitre perfusat ile değiştirin. Dakikada iki mililitre akış hızında böbrekleri perfüzyon devam edin. Tüm hacim teslim edildiğinde, kateter için 100 milimolar glisin ile takviye buz soğuk PBS artı kalsiyum ve magnezyum beş mililitre içeren bir şırınga takın.
Glomeruli' yi glisin çözeltisinin beş mililitresini dakikada iki mililitre akış hızıyla söndürün. Sonra buz soğuk PBS artı kalsiyum ve magnezyum dakikada iki mililitre akış hızı mililitre başına mililitre başına manyetik boncuk 200 mikrolitre ile takviye beş mililitre ile böbrekler perfuse. Glomerulin kahverengi manyetik boncuklarla embolizasyonu böbrek yüzeyinde görünür olacaktır.
Tüm boncuklar teslim edildiğinde böbreklerin kapsül kaldırmak ve hilum de böbrekler hasat. PBS artı kalsiyum ve magnezyum 15 mililitre içeren bir 10 santimetre hücre kültür çanak böbrekler yerleştirin. Mümkün olan en küçük parçalar halinde böbrekler kesmek için yeni bir çift kenarlı bıçak kullanın.
37 santigrat derece 30 dakika kollajenaz A bir mililitre içeren iki mililitretüp içine doku aktarın, modifiye edilmiş bir 1000 mikrolitrelik pipet ucu ile sindirim öncesi ve sonrası yavaşça doku çözeltisi karıştırma. Kuluçka sonunda, sindirilmiş dokuyu 100 mikron luk bir süzgeçten geçirin. Hücre süzgeç için kalan doku püre bir hücre kazıyıcı ve buz gibi PBS artı kalsiyum ve magnezyum kullanın.
Taze buz soğuk PBS artı kalsiyum ve magnezyum ile 50 mililitreye kadar böbrek tek hücre süspansiyon son hacmi ni getirin ve santrifüj ile böbrek hücrelerini toplamak. Supernatant çıkarın sonra biraz daha az ile pelet askıya 1.5 buz soğuk PBS mililitre artı kalsiyum ve magnezyum girdap ve yeni bir iki mililitrelik tüp içine glomerüler süspansiyon aktarın. Glomeruli yıkamak için, glomeruli toplamak için bir mıknatıs içine tüp yerleştirin.
Bir dakika sonra, supernatant kaldırmak için 1000 mikrolitrelik pipet kullanın. Ve tüpü mıknatıstan çıkarın. Dokulara bir mililitre PBS artı kalsiyum ve magnezyum ekleyin.
Pipet glomeruli yukarı ve aşağı bir kez ve girdap hücreleri. Tüpü mıknatısa geri verin ve glomerruliyi az önce gösterildiği gibi tekrar yıkayın. 40-100 X büyütmede ışık mikroskobu analizi ile numune saflığı en az %90'a ulaşana kadar.
Sonra santrifüj tarafından manyetik boncuk safglomerültoplamak. %95'ten daha büyük bir saflık elde etmek için glomerulin gösterildiği gibi iyice yıkanması gerekiyordu. Biotin perfüzyonu, biotin'deki kılcal döngülerin etiketletilmesine yardımcı dır ancak perfüze fare böbreklerinde kontrol edilmez.
Glomerüler ekstrelerin biotin fraksiyonunun immün çökeltisi glomerüler transmembran proteinlerinin nefrin ve podokalsinin biotin ile immünpresipite olduğunu, ancak kontrol fraksiyonu ile olmadığını ortaya koymaktadır. İmmünoprepititated fraksiyonun streptavidin ile boyanması, biotin perfüzyonda biotin kondisyonlu nefrin infilan ama perfüzyonlu hayvanları kontrol edemeyen nefrin varlığını daha da doğrular. Endotel proteini vasküler endotel kadherin ivediliği ve hücre içi adezyon molekülü iki de biotin fraksiyonu içinde immünopsipitated vardır.
Nefrotoksik nefritin erken evresinde nefrotoksik nefrit hayvanlarda kontrollere göre hücre yüzeyi nefrin azaldığı gözlenmiştir. Nitekim densitometik analiz, nefrotoksik nefrit hayvanlarda denetleyicilere göre biotin laded nefrinin önemli bir azalma göstermektedir. Toplam nefrin-aktin oranının nicel analizi kontrol ve nefrotoksik nefrit fareler arasında anlamlı bir fark olmadığını ortaya koymaktadır.
Buna ek olarak, nefrotoksik nefrit ve kontrol hayvanlarında eşit miktarda podosit gözlenir. Geç nefrotoksik nefritte, nefrotoksik nefrit iktisadi hayvanlar, hücre yüzeyi nefrininde kontrol ve nefrotoksik nefrit fareler arasında anlamlı bir farklılık olmayan nefrin ekspresyonunun iyileşmesi ve nefrotoksik nefrittik hayvanlarda toplam nefrin azalması ile birlikte ortaya çıkar. Ayrıca, podosit sayıları kontrol hayvanlara göre azalır.
Bu prosedürü denerken, glomeruli hava embolisi önlemek için kendi bağlantısı sırasında şırınga kabarcık ücretsiz tutmak ve böbrek perfüzyon başladıktan sonra buz soğuk koşullar altında çalışmak için hatırlamak önemlidir. Bu prosedürütaki ard›ndan glomeruli RNA ve protein izolasyonu gibi diğer yöntemler de sağlıklı ve hastalıklı böbreklerde protein ekspresyonu veya etkileşimleri ile ilgili ek sorulara cevap verebilmek için gerçekleştirilebilir.
