Метод мацеризации кислоты может помочь ответить на ключевые вопросы о почках и о том, как конкретные гены способствуют или влияют на развитие нефрона, а также как конкретные условия, такие как диабет или гипертония, влияют на число нефронов. Это важно, так как общее количество нефронов, родившихся с определяется во время развития плода и потеря нефронов была связана с почечной патологией. Основные преимущества метода мацерации кислоты в том, что он быстрее, более воспроизводимым, недорогим и менее трудоемким, чем другие методы подсчета нефрита, такие как магнитно-резонансная томография.
Этот метод облегчает корреляцию влияния числа нефронов на функцию почек, что важно для дальнейшего нашего понимания того, как конкретные гены влияют на функцию и развитие нефрона. Изучение генов или факторов, влияющих на общее число нефронов, будет играть важную роль в разработке фармакологических или генетических подходов, направленных на ограничение связанных с болезнью потерь нефрона. С хорошей экспериментальной техникой и практикой, лица, новые для этого метода должны легко получить освоение метода кислотной мацерации позволяет надежные и воспроизводимые оценки целых номеров нефрона почек.
Начните с помощью тонких хирургических ножниц, чтобы открыть брюшной полости мыши вдоль средней линии. Аккуратно переложите кишечник и репродуктивную жировую часть на правую сторону животного. Используя грубое вскрытие, изолировать левую почку и сократить левую почечную артерию и вену, чтобы тщательно удалить почку размещения органа в надлежащим образом помечены вес лодки PBS.
Соберите правую почку таким же образом и поместите обе почки на хирургическую марлю, предварительно увлажненной PBS. Быстро удалить любые адепты не почечной ткани и почечных капсул. Затем вес каждой почки индивидуально записи веса левого и правого органа отдельно.
После взвешивания, поместите каждую почку обратно в соответствующим помечены вес лодки без PBS и использовать чистый лезвие бритвы, чтобы сократить каждый орган пополам вдоль. Поместите каждую почку наполовину вырезать сторону вниз и сократить каждую половину на два миллиметра или меньше частей. Используя тот же лезвие бритвы, тщательно перенесите нарезанные кусочки почек в соответствующую 15 миллилитровую коническую трубку.
В хорошо проветриваемый дымовой капот добавьте пять миллилитров шести молярной соляной кислоты в каждую трубку. Затем аккуратно агитировать смеси почечной кислоты перед размещением трубок в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение 90 минут. В конце кислотной мацерации прикрепите одну иглу 18 калибра к одному пятими миллилитровому шприцу на почку и тщательно удалите поршень шприца.
Поместите шприцы в отдельные 50 миллилитровых конических трубок в капот дыма и залить почечные растворы в открытый конец каждого шприца, установив пустые трубки в сторону в стойке пробирки. Затем тщательно заменить поршени для медленного экструзии каждого раствора через иглы в 50 миллилитров труб. Вымойте 15 миллилитров конических трубок с пятью миллилитров раствора PBS на трубку закрученного PBS solubilize любой оставшейся ткани почек.
Extrude мыть содержимое в соответствующие 50 миллилитров трубки, как только что продемонстрировали. После экструдирования третьего мытья, оборудовать каждый шприц с 21 калибровочных иглы. Экструд содержание 50 миллилитров труб во второй набор 50 миллилитров труб через меньшие скважины промывки иглы и экструдирования первых 50 миллилитров трубки содержание три раза со свежим PBS, как попродемонстрировано.
После третьей стирки и экструзии, довести общий объем в каждой трубке до 50 миллилитров с дополнительными PBS и поместить трубки в стойку на рокер пластины при четырех градусах по Цельсию на ночь. В течение пяти дней после обработки поместите сетку, содержащую 16 отдельных секций, на дно шести скважин из 12 скважин. Аккуратно инвертировать трубки почечного раствора несколько раз, чтобы повторно использовать гранулы тканей.
Аккуратно добавьте три 500 микролитров алицитов каждого однородного раствора на почку в каждую из трех скважин из 12 колодцев. Разбавить содержимое каждой хорошо с равным объемом PBS. Поместите пластину на сцену перевернутого микроскопа.
Определите гломерули по их сферической структуре, красноватому оттенку и до- или пост артериям, прикрепленным к телам отдельных гломерули. Подсчитайте количество гломерули на каждый сетчатый раздел, чтобы суммировать количество на сетку для расчета общего количества гломерули на колодец. Затем умножьте количество гломерули на колодец раз 100, чтобы получить среднее количество гломерули на почку.
В этом репрезентативном эксперименте общее число нефронов у мышей, пропитанных транспортным средством в течение 14 дней, составило около 12 500 нефронов на почку. Ангиотензин два вливания однако, увеличение предсердий давление примерно на 40 миллиметров ртутного столба и был связан со значительным почти 26%сокращение общего числа нефронов. В этой генетической модели крысы почечного агенеза, животные, родившиеся с двумя почками были рассчитаны содержать около 27500 нефронов на почку после кислотной мацерации, как попродемонстрировано, в то время как крысы, рожденные с одиночной почки было установлено, что значительно ниже общее число нефронов.
Оценки обоих экспериментов соответствовали диапазонам, ранее зарегистрированным у крыс. Метод мацеризации кислоты идеально подходит для оценки нефронов в целых почках, особенно в лабораториях, не оборудованных более трудоемкими и дорогостоящими методами подсчета нефронов, такими как метод дисэкторного фракционатора или магнитно-резонансная томография. Этот метод позволяет высокую пропускную способность, эффективную и воспроизводимую оценку количества нефрона всей почки, которое находится в пределах 5% от числа, определяемого магнитно-резонансной томографией.
Оценка числа нефронов имеет клиническое значение, поскольку снижение числа нефронов было связано с повышенным риском сердечно-сосудистых заболеваний, таких как хронические заболевания почек. Не забывайте, что работа с соляной кислотой может быть чрезвычайно опасной и что следует принимать меры предосторожности, такие как ношение перчаток, защитных очков и лабораторного пальто.
